A DNS-izoláláshoz hasonlóan a tudósok általában RNS-izolációs készletekre támaszkodnak, hogy megkönnyítsék életüket. Nemrégiben közzétettünk egy blogot a készlet nélküli DNS-tisztításról, amely számos okot vázolt fel, hogy miért van előnye annak, ha valamit készlet nélkül csinálunk: kevesebb műanyag hulladék, kevesebb költség, és kevésbé marad egy csomó véletlenszerű megoldás, amikor az összes spin oszlop elfogy. Ebben a cikkben az RNS izolálásának alapjait fedjük le készlet nélkül.

tippek az RNS-szel való munkavégzéshez (függetlenül attól, hogy készletet használ-e vagy sem)

bár magától értetődik, hogy bármilyen típusú DNS-vagy RNS-tisztítást kell végezni a szennyeződés elkerülése érdekében, különös figyelmet kell fordítani az RNS-extrakció végrehajtásakor. Az RNS eredendően nem olyan stabil, mint a DNS – egyszálú, és ribózcsoportjai érzékenyek a hidrolízisre és a hőbontásra. Ezenkívül az RNÁZOK vagy az RNS-t lebontó enzimek különösen szívós fehérjék, amelyek mindenben megtalálhatók, beleértve a bőrt is. Íme néhány általános tipp az RNS-szel való munkavégzéshez, még akkor is, ha készletet használ:

• mindig viseljen kesztyűt, mivel a kezén lévő Rnázok lebonthatják az RNS-t.
• tartson tiszta munkaterületet, amely magában foglalhatja a pad permetezését egy termékkel, hogy megszabaduljon az Rnázoktól, például az RNaseZAP-tól.
• a szövetek, sejtek, növények, gombák vagy baktériumok betakarításakor tartsa hidegen a mintákat, és gyorsan dolgozzon az RNS lebomlásának enyhítésére.
• ügyeljen arra, hogy DEPC-vel kezelt vagy RNAse-mentes vizet használjon. DEPC-vel kezelt víz használata esetén autoklávozza a vizet a DEPC inaktiválásához.
• győződjön meg arról, hogy a használt műanyag vagy üvegáru RNase mentes. Az RNase-mentes Műanyagáruk tudományos beszállítóktól könnyen beszerezhetők, az üvegárukat DEPC oldattal kell kezelni 1 órán keresztül, és autoklávozni kell a maradék DEPC eltávolítása érdekében. Alternatív megoldásként az üvegáruk 180 C-os hőmérsékleten süthetők legalább 4 órán keresztül.
• ha a végső RNS-Mintá(ka) t vízben vagy te pufferben reszuszpendálják, az RNS lebomlásának megakadályozása érdekében tárolja őket egy -80cl C fagyasztóban. Ezek lebomlanak egy -20-as C-es fagyasztóban.

az RNS-extrakciós módszerek egy egyszerű protokollt fejlesztettek ki, amelyet ma is használnak

számos alternatív módszer létezik a DNS izolálására készlet nélkül. Ez azonban nem igaz az RNS kivonására és tisztítására. Van egy egyszerű módszer, amely működik, és annak variációi. Az RNS izolálására szolgáló protokollok kifejlesztésének egyik fő akadálya az volt, hogy az rnázok általában megtalálhatók a sejtekben, és anélkül, hogy valami blokkolná az RNáz aktivitását a sejtlízis során, az RNS lebomlik. Az intakt RNS hatékony izolálásához gyors, erős protein denaturálószerre lenne szükség-valamire, amely lebontotta az Rnázokat, mielőtt az Rnázoknak esélyük lett volna az RNS lebontására a sejtlízis során.

Az 1970-es évek végén Chirgwin és munkatársai kimutatták, hogy egy erős fehérje denaturáló szer, a guanidinium-tiocianát éppen ezt tette (Chirgwin et al., 1979). Kifejlesztettek egy protokollt az RNS izolálására patkánylépekből, amelyben guanidinium-tiocianát oldatban homogenizálták a lépeket, és a homogenizátumot az oldhatatlan anyag eltávolítása érdekében megpördítették. Ezután a homogenizátumot cézium-klorid gradiensekre töltöttük, és 20 órán keresztül ultracentrifugáltuk, hogy az ép RNS-t elkülönítsük a DNS-től és a fehérjéktől. Bár nagyon hatékony a teljes RNS izolálásában, ez a módszer sok időt igényel, és attól függően, hogy hány mintával rendelkezik, hozzáférést biztosít egy vagy több nagy, drága ultracentrifugához.

1.ábra: az RNS-extrakció különböző lépéseinek vázlata.

a NIH kutatói az 1980-as évek közepén egy olyan protokoll kidolgozását tűzték ki célul, amely teljesen kihagyta az ultracentrifugációt. Chomczynski és Sacchi kimutatta, hogy az RNS hatékonyan elválasztható a DNS-től és a fehérjéktől egy egyszerű extrakciós protokoll segítségével guanidinium-tiocianát-fenol-kloroformmal. Ebben a módszerben a mintákat még homogenizálják és guanidinium-tiocianát-oldatban lizálják. A cézium-klorid gradiensekkel történő RNS-elválasztás helyett azonban vízzel telített fenolt, nátrium-acetátot és kloroformot adunk a homogenátumhoz, és rázzuk. Gyors centrifugálás után (nem ultracentrifugáció!), a fenol és a kloroform rétegei elkülönülnek, és az RNS megmarad a felső, vizes rétegben, míg a DNS és más fehérjék megmaradnak az interfázisban és az alsó, szerves rétegben. A felső vizes réteget extraháljuk, majd az RNS-t izopropanollal kicsapjuk. Ez a módszer csökkentette az RNS izolálásához szükséges időt 20 + óráról körülbelül 4 órára, és ennek a kit nélküli módszernek a variációi ma is széles körben használatosak (Chomcynski and Sacchi, 2006).

tekintse meg az RNS extrakciós protokollunkat!

az egyszerű protokoll még bolondbiztosabbá tétele (még készlet nélkül!)

mint már említettük, az RNS-sel való munka megköveteli a minták hideg tartását a homogenizációig és a sejtlízisig. Ez kihívást jelenthet a laboratóriumi helyzettől vagy a szövetgyűjtési módszertől függően, így a biotechnológiai vállalatok számos olyan terméket forgalmaztak, amelyek segítenek tovább egyszerűsíteni ezt a folyamatot és/vagy stabilizálni az RNS-t a szövetgyűjtés és a homogenizálás során. Ezek közül a legismertebb a trizol (más néven Tri-reagens), a Rnazol (Rnazol), a QIAzol (qiazol), amelyet számos vállalat forgalmaz). A trizol egy all-in-one sav-guanidinium-fenol oldat, amely egy lépésben egyesíti a homogenizáló oldatot és az eredeti no-kit protokoll fenol hozzáadását. A trizol-ban végzett homogenizálás után az oldhatatlan anyagot centrifugálással távolítjuk el, majd a felülúszót kloroformmal extraháljuk a fenti no-kit módszer szerint.

a kutatók kifejlesztettek módszereket az RNS “stabilizálására” a szövetekben a sejtlízis előtt. Ezek a termékek, nevezetesen a Thermo rnalater és a Qiagen rnaprotect által termelt rnaprotitok ammónium-szulfát alapú oldatok, amelyek gátolják az RNáz aktivitását a sejtekben vagy szövetekben – valójában nem stabilizálják kémiailag az RNS molekulákat (Allewell és Sarma, 1974). Továbbá, ThermoFisher biztosít egy protokollt, hogyan kell integrálni rnalater antioxidánsok alkalmazásával trizol és ammónium-szulfát stabilizáló oldatok lehet tenni a házban.

a kit nélküli RNS-extrakciós módszerek gyakori problémája a DNS átvitele, amely potenciálisan bonyolíthatja egy downstream alkalmazás eredményeit, például kvantitatív PCR a génexpresszió értékeléséhez. A kutatók számos dolgot tehetnek ennek a kérdésnek a leküzdésére. Először is, vegye figyelembe az extrakciókat – ha igazán tiszta RNS-re van szüksége, fontos, hogy a kivonáskor csak a vizes réteget vegye be, hogy elkerülje a DNS átvitelét az alsó, szerves rétegből. Egy másik trükk az RNS kicsapása lítium-klorid alkalmazásával. A LiCl oldatok szelektíven kicsapják az RNS-t, de a DNS-t és a fehérjéket nem. Végül egy DNáz használata (a piacon számos DNáz enzim termék közül lehet választani) a reszuszpendált RNS mintán segít biztosítani, hogy a DNS-szennyeződés ne jelentsen problémát.

Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ (1979) biológiailag aktív ribonukleinsav izolálása ribonukleázban dúsított forrásokból. Biokémia 18: 5294-5299. https://doi.org/10.1021/bi00591a005

Chomczynski P, Sacchi N (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1:581–585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83