Cytopathic effect (CPE): hogyan jutnak el a vírusok a gyilkosságtól?

a vírusok definíció szerint láthatatlanok a szemünk számára. Ezek olyan nanoszerkezetek, amelyek csak elektronmikroszkóppal válhatnak láthatóvá, ez egy időigényes technika, amely nem mindenki számára elérhető. Ennek következtében a virológusnak alternatívákat kell találnia ahhoz, hogy képes legyen dolgozni és tanulmányozni az érdeklődésre számot tartó tárgyát. A vírusfertőzés “látásának” és közvetett mérésének gyakorlati módja a vírus által a sejtnek okozott károk vizsgálata. Ezt a szenvedést vagy károsodást citofatikus hatásnak (CPE) nevezik, mérését széles körben használják a virológiai laboratóriumokban az egész világon.

a CPE egy nagyon alapvető megközelítés annak megértéséhez, hogy egy vírus hogyan fertőz meg egy sejtet, de ez nem jelenti azt, hogy csak az alapvető tudományos kutatásokban használják. A CPE-k mérése szintén nagyon hasznos lehet a gyógyszeripari vállalatok és diagnosztikai laboratóriumok számára.

mi a vírus által kiváltott citofatikus hatás?

a vírusok olyan paraziták, amelyeknek gazdasejtre van szükségük a szaporodáshoz. A sejt belsejében eltérítik a sejtszerkezetet, hogy saját fehérjéket, nukleinsavat és membránt állítsanak elő (ha szükséges).

mivel a vírus olyan celluláris tényezőket foglal el, amelyeket a sejt egyébként használ, replikációja megváltoztathatja a gazdasejtek alapvető funkcióit, vagy akár elpusztíthatja azt. A vírusfertőzésből eredő sejtváltozások vagy változások halmaza CPEs néven ismert. Ezek általában negatív változások, amelyek strukturális, metabolikus vagy funkcionális módosításokat okozhatnak a fertőzött sejtben. Idővel a CPEs a vírus (a betegség) patológiás hatásait idézheti elő.

A citopátiás hatás klasszikus példái

egy jól ismert vírus által kiváltott-CPE a sejthalál(nézzen meg egy haldokló sejt videóját). Sok vírus megöli a sejteket lízissel vagy apoptózis indukálásával. Például a HIV ismert a CD4+ T limfociták elpusztításáról, ami a fő oka annak, hogy a fertőzött egyének immunhiányos állapotba kerülnek.

a laboratóriumban a szúnyogsejt-vonal (például a C6/36) vagy a Vero-sejtek megölésének egyszerű módja az, ha bármilyen híres arbovírussal, például Chikungunya, Dengue vagy Zika-val fertőzik meg. Néhány napos fertőzés után a sejtek csak szétesnek a szemed előtt (ábra. 1).

1.ábra | A Vero sejteket Zika vírussal fertőzték meg. 72 óra fertőzés után egyértelmű CPE nyilvánvaló a sejtes debri jelenlétével a sejthalál következtében.

egy másik CPE példa a syncytia képződés. A burkolt vírusokkal fertőzött sejtek vírusfehérjéket expresszálnak plazmamembránjukon, amelyeket a vírusok használnak a gazdasejttel való fúzió közvetítésére. Amikor ezek a vírusfehérjék a szomszédos sejtek felszínén lévő receptorokhoz kötődnek, sejt–sejt fúzió történik, ami syncytia képződést eredményez (többmagvú óriássejt).

a légzőszervi syncytial vírus (RSV) a vírusos tüdőgyulladás fő oka kisgyermekeknél. Neve abból a tényből származik, hogy sejttenyészetben, de figyelemre méltóan a fertőzött betegek tüdejében is kialakulhat syncytia.

a CPE-vel kapcsolatos változások a sejtmorfológiában magukban foglalják a tapadó sejtek kerekítését, leválasztását és/vagy csomósodását is. Ebben az esetben a fertőzött sejtek metabolikusan aktívak maradnak a vírus replikálására, de citoszkeletonjuk megváltozik. A morfológiai változások a felületi adhéziós fehérjék expressziójának lefelé történő szabályozásával magyarázhatók a fertőzés következtében. Például az Ebola-vírusról ismert, hogy drámai morfológiai változásokat okoz az adherens sejtekben azáltal, hogy csökkenti az integrin expresszióját.1.

tényleg szüksége van annyi drámára (halál, gigantizmus, deformáció), hogy CPE-nek lehessen tekinteni? Nem. A sejtek fertőzéskor csak” viselkedhetnek ” másképp, de ugyanúgy néznek ki. A finomabb, de még mindig egyértelmű CPE-típusú változások magukban foglalhatják a növekedési sebesség/kinetika változását, az adott metabolikus aktivitás változásait vagy a sejtfunkció változásait. A különböző vírusok között, amelyek kiválthatják az ilyen típusú CPEs-t, a Zika vírus áll. 2015-ben ez a szúnyog által terjesztett vírus az egész hírben volt, mert mikrocefáliát okoz, súlyos neurológiai károsodást, amelyet az agy csökkentett mérete jellemez a magzatokban. Később leírták, hogy a mikrocefália számos Zika által kiváltott citopátiás hatás eredménye az idegsejtekre, beleértve a sejt hipertrófiáját, a növekedés korlátozását, a sejtciklus diszregulációját és a sejthalált. Kolóniaképződési vizsgálatot használtunk például annak azonosítására, hogy a különböző Zika fehérjék közül melyik zavarja a sejtproliferációt.

azoknak a kutatóknak, akik szisztematikusan összehasonlítják a sejtvonalak növekedési kinetikáját, javasoljuk a CytoSMART Omni-t. Egész kutak kinetikus élő sejtes képalkotása, automatizált szkennelési és képvarrási szoftver segítségével. Kép teljes jól lemezek óráktól hetekig egy időben.

A citopátiás hatások a vírus-gazdaszervezet kölcsönhatások eredménye

fontos megemlíteni, hogy a CPE-t nemcsak a vírus, hanem a gazdasejt is meghatározza. Attól függ, hogy a sejtek mennyire engedékenyek a fertőzésre. Mivel megengedő sejt, amely támogathatja a vírus növekedését. Más szavakkal, nem minden vírus képes megfertőzni az összes sejttípust. Hogy egyszerű legyen, azt mondhatjuk, hogy:

• nem megengedő cell-vírus nem képes megfertőzni
• megengedő cell – vírus képes replikálni, de nem okoz nyilvánvaló CPE
• erősen megengedő cell – vírus replikálja és indukál nyilvánvaló CPE

így ha hozzá vírus a sejtek, és semmi sem történik, ne aggódj. Csak meg kell találnia a megfelelő vírus-sejt kombinációt.

leolvasások – hogyan mérjük a CPE-t?

a vírus által kiváltott sejtváltozások, például a sejthalál vagy a megváltozott morfológia fénymikroszkóppal láthatók. Csak tegye a lemezt egy szabványos fordított mikroszkóp alá, és nézze meg, hogy a sejtjei meghaltak-e, vagy valahogy megváltoztak-e. Ennek a megközelítésnek az a pozitív aspektusa, hogy “könnyű”, mert nem igényli a minta feldolgozását, ami elkerüli a tárgyak rögzítését vagy festését.

hátránya, hogy kvalitatív és nem kvantitatív, és nagymértékben támaszkodik a megfigyelő képzésére. Manapság ez a megközelítés automatizálható a vírus által kiváltott citopatogenezis valós idejű monitorozásával. Például a sejtek terjedésének és proliferációjának vírusváltozásait sebgyógyító vizsgálattal lehet felmérni, ahol a csökkent kollektív és egysejtű migrációs sebesség kimutatható a sejtek morfológiájában bekövetkező súlyos változásokkal együtt. Egy másik kvantitatív megközelítés a sejtproliferáció ellenőrzése automatizált képelemzéssel. Ezzel a technológiával lehetséges a fertőzött vs. nem fertőzött sejttenyészetek a vírusfertőzés citopátiás hatásának megfelelő számszerűsítésére.

Ha a halálsejtek teszik a napot, egy alternatíva a híres Plakkvizsgálat. Ezt a klasszikus virológiai technikát használják a fertőző vírusrészecskék számszerűsítésére, és azon az elven alapul, hogy a vírusok sejtlízist indukálhatnak. Az erősen megengedő sejtek egyrétegének megfertőzése után a sejteket kristály ibolyával ellensúlyozzák (az élő sejtek színezettek, a halálsejtek festetlenek maradnak), ami gyönyörű plakkokat (a halálsejtek területeit) eredményez, amelyek szabad szemmel könnyen számszerűsíthetők.

de nem kell látnod a sejtjeidet, hogy tudd, hogy halál. A fertőzés utáni sejt életképessége mérhető az intracelluláris ATP-koncentráció firefly luciferázzal vagy a hagyományos MTT-vizsgálattal történő számszerűsítésével.

a vírusokkal való munka gondot okozhat, a BSL-3/4 laboratóriumok szigorú biztonsági intézkedésekkel rendelkeznek, és a laboratóriumba való bejutás és a laboratóriumból való kilépés sok időt vesz igénybe. Azoknak a kutatóknak, akik megoldást keresnek sejtjeik megfigyelésére, anélkül, hogy be kellene lépniük a laboratóriumba, javasoljuk, hogy nézze meg a CytoSMART Lux2 Duo készletet.

Alkalmazások

a vírus CPE-t indukál? Tisztán látod vagy méred? Zseniális! Ezt a CPE-t sikeres vírusfertőzés vagy replikáció leolvasásaként használhatja. Egy adott CPE indikátorként szolgálhat a fertőzés megelőzésének, a fertőzés bekövetkezéséhez szükséges gazdaszervezet vagy kórokozó tényezők jellemzésének, többek között a vírus tropizmusának azonosításához. A gyakorlatban ez azt jelenti, hogy lehet használni, mint kiolvasás:

• szűrés és értékelése antivirális vegyület
  lehet egy gyógyszer jelölt megakadályozza CPE kialakulását?
• semlegesítő antitestek szűrése
  gátolhatja-e egy adott antitest a vírus által kiváltott CPE-t?
• a vírusellenes gyógyszerrezisztencia megfigyelése(fenotipizálás)
  egy adott vírus izolátum indukálhatja-e a CPE-t vírusellenes gyógyszerek jelenlétében?
• a vírus tropizmusának jellemzése
  mely sejttípusok előnyösen fertőzöttek egy vírussal? Miért? (Ellenőrizze a legújabb kiadvány a hírhedt SARS-CoV-2.)
• a vírusos betegségek diagnosztizálása
  egy vírus aktívan fertőz egy személyt? Az adott személytől gyűjtött klinikai minta indukálja a CPE-t? Ne feledje, hogy a legtöbb diagnosztikai módszer (ELISA, RT-qPCR) nem érzékeli a fertőző vírusrészecskéket.

következtetésképpen …

bár a vírusfertőzés mérésének számos módja van, a megengedő sejtekben a CPE-k ellenőrzése továbbra is széles körben alkalmazott alternatíva. Ahhoz, hogy valóban hasznos legyen, meg kell találnia a megfelelő kombinációt: egy vírust, egy megengedő sejtet és egy pontos leolvasást. Miután megtalálta ezt a kombinációt, az alkalmazások meglehetősen változatosak és hasznosak lehetnek akár tudományos környezetben, az iparban, akár a klinikai diagnosztikában.

Tudjon meg többet az összes CytoSMART képalkotó megoldásról itt