DNA単離と同様に、科学者は一般的にRNA単離キットに依存して生活を楽にします。 最近、私たちはキットなしでDNA精製に関するブログを公開し、キットなしで何かをすることが利点を持っているいくつかの理由を概説しました。 この記事では、キットなしでRNAを単離する基本について説明します。

RNAを扱うためのヒント（キットを使用しているかどうかにかかわらず）

汚染を避けるためにDNAまたはRNAの精製を行うたびに注意する必 RNAは本質的にDNAほど安定ではありません-それは一本鎖であり、そのリボース基は加水分解および熱分解の影響を受けやすいです。 さらに、RNASE、またはRNAを分解する酵素は、あなたの肌を含むすべてのものに見られる特に丈夫なタンパク質です。 キットを使用している場合でも、RNAを扱うための一般的なヒントをいくつか紹介します。

• 手のRnaseはRNAを分解する可能性があるため、常に手袋を着用してください。
• rnasezapなどのRNasesを取り除くために製品をベンチに噴霧することを含むことができるきれいな作業領域を保ちます。
• 組織、細胞、植物、真菌、または細菌を収穫するときは、サンプルを低温に保ち、RNA分解を軽減するために迅速に作業します。
• DEPC処理された水またはRNAseフリー水を使用してください。 DEPC扱われた水を使用したら、DEPCを不活性にするために水をオートクレーブに入れて下さい。
• 使用されるプラスチック製品またはガラス製品がRNaseフリーであることを確認します。 RNaseなしのplasticwareは科学的な製造者からすぐに利用でき、ガラス製品は1時間DEPCの解決と扱われ残りDEPCを取除くためにオートクレーブに入れられるべきです。 また、ガラス製品は少なくとも4時間180°Cで焼くことができます。
• 最終的なRNAサンプルを水またはTEバッファーに再懸濁した場合は、RNAの分解を防ぐために-80℃の冷凍庫に保管してください。 それらは-20°cのフリーザーで低下します。

RNA抽出方法は、今日でも使用されている単純なプロトコルに進化しました

キットなしでDNAを単離するための多くの代替方法があ しかし、それはRNAの抽出と精製の場合ではありません。 動作する一つの簡単な方法、およびその方法にバリエーションがあります。 RNAを単離するためのプロトコルを開発するための主要なハードルは、Rnaseが一般的に細胞中に見出され、細胞溶解時にRNase活性を遮断するものがなければ、RNAは分解されるということであった。 無傷のRNAを効果的に単離するためには、高速で強力なタンパク質変性剤が必要であり、Rnaseが細胞溶解時にRNAを分解する機会を得る前にRnaseを分解す 1970年代後半、Chirgwinらは、強力なタンパク質変性剤であるグアニジニウムチオシアネートがこれだけを行うことを示した（Chirgwin et al., 1979). 彼らは、ラット脾臓からRNAを単離するためのプロトコルを開発し、グアニジニウムチオシアン酸溶液中で脾臓を均質化し、不溶性物質を除去するためにホモジネートをスピンダウンさせた。 その後、ホモジネートをセシウム-塩化物勾配上にロードし、最大20時間超遠心して、無傷のRNAをDNAおよびタンパク質から分離した。 総RNAの単離には非常に効果的ですが、この方法は多くの時間を必要とし、サンプルの数に応じて、1つ以上の大型で高価な超遠心分離装置にアクセ

図1:RNA抽出のさまざまなステップの概要。

1980年代半ばのNIHの研究者は、超遠心分離を完全にスキップするプロトコルを開発するために着手しました。 ChomczynskiとSacchiは、グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルムを用いた簡単な抽出プロトコルによって、RNAがDNAおよびタンパク質から効果的に分離できることを示した。 この方法では、サンプルはまだguanidiniumのチオシアン酸塩の解決で均質化され、溶解します。 しかし、塩化セシウム勾配を用いたRNA分離の代わりに、水飽和フェノール、酢酸ナトリウム、クロロホルムをホモジネートに加え、振とうする。 迅速な遠心分離の後（超遠心分離ではありません！）、フェノールおよびクロロホルムの層は分離し、RNAは上部の水層に保持され、DNAおよび他のタンパク質は間期および底部の有機層に保持される。 上部の水層を抽出し、次いでＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させることができる。 この方法は、ＲＮＡを単離するのに要した時間を２ ０＋時間から約４時間に短縮し、このキットなしの方法のバリエーションは、今日でも広く使用されている（Ｃｈｏｍｃｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，２ ０ ０ ６）。

RNA抽出のための私たちのプロトコルを見てください！

シンプルなプロトコルをさらに確実にする（まだキットなし！)

上記のように、RNAを扱うには、均質化と細胞溶解までサンプルを冷たく保つ必要があります。 これはあなたの実験室の状態かティッシュのコレクション方法によって挑戦する場合もある従ってバイオテクノロジーの会社は更にこのプロセスを流線形にし、および/またはティッシュのコレクションおよび均質化の間にRNAを安定させるのを助ける複数のプロダクトを販売した。 これらの製品の中で最も広く知られているのは、TRIzol®（TRI Reagent®、RNAzol®、QIAzol®とも呼ばれ、多くの異なる企業によって販売されています）です。 TRIzol®は、均質化溶液と元のno-kitプロトコルのフェノール添加をワンステップに組み合わせたオールインワン酸-グアニジニウム-フェノール溶液です。 Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）中で均質化した後、不溶性物質を遠心分離によって除去し、上清を上記のｎｏ−ｋｉｔ法と同様にクロロホルムで抽出する。 研究者らはまた、細胞溶解前に組織内のRNAを「安定化」する方法を開発しました。

これらの製品、すなわちThermoのRNAlater®およびQiagenのRNAProtect®は、細胞または組織内のRNase活性を阻害することによって働く硫酸アンモニウムベースの溶液であり、実際にはRNA分子を化学的に安定化させることはありません(Allewell and Sarma,1974)。 さらに、ThermoFisherはTRIzol®の使用を用いるRNAlater®を統合する方法で議定書を提供し、アンモニウムの硫酸塩の安定の解決は家で作ることができる。

キットなしのRNA抽出方法の一般的な問題は、遺伝子発現を評価するための定量的PCRなどの下流アプリケーションの結果を複雑にする可能性があ 研究者は、この問題に対処するために行うことができますいくつかのことがあります。 まず第一に、あなたの抽出に留意してください-あなたが本当にきれいなRNAを必要とする場合は、抽出するときに、唯一の底、有機層からDNAの持ち越しを 別のトリックは塩化リチウムを使用してRNAを沈殿させることです。 LiCl溶液はRNAを選択的に沈殿させるが、DNAおよびタンパク質は沈殿させない。 最後に、再懸濁されたRNAサンプルにDNase（市場にはいくつかのDNase酵素製品があります）を使用すると、DNA汚染が問題ではないことを確認するのに役立ちます。 Chirgwin JM,Przybyla AE,MacDonald RJ,Rutter WJ(1979)リボヌクレアーゼに富む供給源からの生物学的に活性なリボヌクレ酸の単離。 生化学18：5294-5299。 https://doi.org/10.1021/bi00591a005

Chomczynski P, Sacchi N (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1:581–585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83