バクテリオファージは、ファージとも呼ばれ、細菌に特異的に感染するウイ バクテリオファージは、最初に細菌の細胞壁に付着し、その遺伝物質を注入することによって、その感受性宿主に感染する。 その後、彼らは細胞の生合成機構をハイジャックしてDNAを複製し、多数の子孫ファージ粒子を産生し、宿主細胞を溶解して殺すことによって放出する。
この溶解活性は、プラークアッセイまたは二重寒天層アッセイとして知られている広く使用されているファージ列挙技術の基礎です。
この溶解活性は、プラークアッセイまたは二重寒天層アッセイとして知られている。 ここでは、バクテリオファージミックスは、低濃度の寒天を含む溶融栄養ブロス中で最初に調製される。 ミックスで使用されるすべての細菌は生きていると積極的に細菌の大部分が実行可能であり、プラークの周りに密な芝生を形成することができるこ 次に、この溶融細菌-ファージ寒天ミックスは、すでにペトリ皿上で凝固されているより固体、濃縮寒天栄養培地上に広げられます。 室温でのインキュベーションでは、低濃度の寒天-ファージ-細菌ブロスも凝固して柔らかい寒天オーバーレイを形成する。ここで、細菌細胞は底層から追加の栄養素を得ることができ、急速に増殖して細菌の合流した芝生を生成する必要があります。
ここで、細菌細胞は しかし、ファージ粒子も軟質層に存在するので、これらは細菌内でそれらの遺伝物質に感染して複製し、細胞溶解に至り、複数の子孫を放出する。 これらのファージ子孫は、細菌-ファージ層の半固体状態がそれらの移動をより遠くに位置する宿主細胞に制限するので、隣接する細胞に感染する。 この感染と溶解のサイクルは複数回にわたって続き、局所的な領域で多数の細菌が死亡します。 破壊されている隣接する細胞の効果は、効果的にファージの細菌溶解活性を増幅し、それらの列挙を可能にする、肉眼で見ることができるプラークと呼
ペトリ皿上のプラークの数は、プラーク形成単位、またはPFUsと呼ばれ、初期バクテリオファージ濃度が十分に希釈されていれば、元のサンプル中の感染性ファージ粒子の数に直接対応する必要があります。 この技術はまた、プラーク形態の特性評価のために、ファージ型の同定を支援するために、またはファージ変異体を単離するために使用することができる。 この研究室では、大腸菌のT7ファージを例として、ファージを列挙するためのプラークアッセイの実行方法を学びます。
まず、宿主細菌細胞およびバクテリオファージの培養に適した培地を同定する。 ここで、溶解生成ブロス、またはＬＢ培地を使用して、ｅ．ｃｏｌｉおよびＴ７ファージを培養した。 次に、3つのきれいなガラスビンを取り、媒体、名前とのそれらを分類し、次にLB-ブロスとして最初、LB-底寒天として第2、およびLB-上の寒天として第3。 今度は、3セットの前作り出されたLBの粉の4グラムを重量を量り、次に各びんに1組の重量を量られた乾燥された媒体を移して下さい。 最初のボトルに200ミリリットルの水を加えます。 磁気攪拌棒を使用して内容物を混合する。
次に、pH計と一定の攪拌を使用して、水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加して最終pHを7.4にする。 他の2つの残りのボトルについても、水の添加とpHの調整を繰り返します。 今度は、寒天の粉の三グラムを重量を量り、1.5%の最下の寒天を作るために第二のびんに加えて下さい。 最後に、体重を計る1。 2寒天のグラムと作るために第三のボトルに追加します.6%LBの上の寒天。 瓶の中のブロスの状態は、寒天の添加を必要としない。 次にびんに半堅く帽子をかぶせ、121の摂氏温度で20分のオートクレーブによって媒体を殺菌して下さい。 完了したら、オートクレーブから媒体のびんを取除き、すぐに汚染を防ぐためにそれらを十分に閉めるようにビンの王冠をねじって下さい。 後で使用するために、LB-ブロスとLB-Top寒天培地をベンチに置いてください。 約45℃に設定されている水浴中で冷却するLB底寒天を置きます。
LB底寒天が約45℃に達したら、作業台に移します。 次に、70％エテノールを使用してワークスペースを滅菌します。 次に、2の最終濃度を作るために溶融底寒天に滅菌一モル塩化カルシウムの450マイクロリットルを追加します。25ミリモル 穏やかに混合するためにびんを渦巻かせなさい。 その後、七つのきれいなペトリ料理を設定します。 媒体名および準備の日付の底の各皿に分類しなさい。 次に、7つのペトリ皿のそれぞれに15ミリリットルの底寒天を注ぎます。 プレートを数時間または室温で一晩置くことができます。 一度設定すると、培養プレートは、必要に応じて数日間摂氏4度で保存することができ、結露を最小限に抑えるために逆さまにすることができます。 試金の1時間前に4つの摂氏温度冷却装置からの37の摂氏温度の定温器にペトリ皿を移して下さい。
アッセイが事前形成される前日に、大腸菌を培養する必要があります。
ここで、１ ０μ ｌのｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ ０μ ｌのＬＢ−Ｂｒｏｔｈに接種した。 160RPMで摂氏37度に設定された振盪インキュベーターに一晩成長する細菌を配置します。 その後、アッセイの日に、インキュベーターから細菌培養物を除去する。 一晩培養の0.5ミリリットルと新鮮なLBブロスの新鮮な10ミリリットルを播種します。 これらの細胞を160RPMで摂氏37度に設定された振盪インキュベーターに成長させるために配置します。 次に、この文化が0.5から0.7の光学密度によって示される対数段階の成長にいつ達するか点検するのに分光光度計を使用して下さい。 ODがこのレベルに達したら、ベンチに細胞培養を移すことによって孵化を停止して下さい。 それらはファージの上敷の試金に使用されて今準備ができている。
ファージ力価は、異なるファージの種類およびサンプル間で指数関数的に変化し得る。
ファージ力価は、異なるファージの種類 したがって、それらを効果的に数えるためには、それらを希釈して広範囲のファージ濃度を生成する必要があります。 試金の日に、10倍の希薄の技術に続く10から百万の集中まで及ぶ一連のファージの希薄を、発生させて下さい。 統計的に有意で正確なデータを得るには、連続希釈を3回行います。
次に、電子レンジを使用して固化したLBトップ寒天を溶かします。 次に、摂氏45度に設定された水浴に1時間置きます。 一時間後、インキュベーターから底寒天層を含むペトリ皿を収集します。 ファージ濃度とアッセイ日付でプレートにラベルを付けます。 その後、7つのきれいな試験管を設定します。 各試験管に連続ファージ希釈番号をラベルし、対照として1つを指定します。
LBトップ寒天が摂氏45度に達したら、作業台に移します。 今度は、2.25millimolarの最終的な集中を作るために200milliliterの寒天に1モルの塩化カルシウムの450のマイクロリットルを加えなさい。 穏やかに混合するためにびんを渦巻かせなさい。 次に、35ミリリットルのLB-top寒天と4ミリリットルの細菌懸濁液を滅菌円錐管に加えます。 穏やかに均等に細胞を配るが、泡立つことを防ぐために揺れることを避けるために渦巻いて下さい。
さて、この細菌トップ寒天ミックスのaliquot五ミリリットルは、七つの試験管のそれぞれに。 それから、丁重に分類された試験管にbacteriophage無しで単に媒体であるべきである連続的に薄くされたbacteriophageのサンプルおよび制御媒体の100つのマイクロリットルを 適切な混合を保障するために混合物を穏やかに渦巻かせて下さい。 それぞれのペトリ板にバクテリオファージミックスの五ミリリットルを静かに移します。 均等に穏やかにペトリの版を渦巻かせることによって全表面中の組合せを広げなさい。
すべてのペトリ板を混合物で層状にしたら、室温で15分間インキュベートすることによって最上層の凝固を可能にする。
これらのステップが完了した後、残りの2組のファージ希釈液を使用して、2組目のペトリ皿と3組目のペトリ皿のプロセスを繰り返します。 各皿をパラフィルムで密封し、室温で15分間インキュベートする。 培養プレートを適切な温度で24時間またはプラークが発達するまで逆さまに置きます。 ここでは、プレートを37℃のインキュベーターに一日置き、Eの刺激的な成長条件とした。 大腸菌およびT7ファージ。
プラークは、細菌の種、インキュベーション条件、および培地の選択に応じて、インキュベーションの一から五日後に表示されます。 ここでは、プラークは、摂氏37度でインキュベーションの一日後に表示されました。 コントロールとマークされたプレートをチェックすることから始めて、これがウイルス汚染を示すので、これらのプレートにプラークが形成されていないことを確認してください。 元のサンプルのファージ力価を決定するには、最初に最も希釈されたファージサンプルを含むプレートから始め、蓋を取り外さずにプラークを数え、どのファージがすでにカウントされているかを示すようにマークします。 各セットの各版のためのカウントを繰り返しなさい。 いくつかのプレートは、カウントするにはあまりにも多くまたは少なすぎるプラークを持 理想的なプラーク数として10から150を考えてみましょう。
次に、異なる希釈と複製のプラーク数の値を一覧表示するテーブルを生成します。 次に、理想的なプラーク数を含む希釈プレートの平均プラーク数値を計算します。 この例では、これらは10からマイナス三および10からマイナス四希釈プレートに形成されたプラークの平均数であった。 ここで、得られた平均プラーク値をそれぞれのファージ希釈因子で割ることにより、ファージ希釈因子を調整する。 ここでは、10-マイナス三および10-マイナス四希釈プレートに形成されたプラークの平均数を、それぞれの希釈係数で割って、100マイクロリットルのファージ混合物中のプラーク形成ユニットの数、またはPfuを得た。 この値を１ミリリットル当たりのＰＦＵに変換するために、生成された値に１ ０を乗算し、バクテリオファージオーバーレイ調製ステップ中に１ ０ ０μ ｌのファージ希釈ミ 最後に、異なる希釈プレートから得られた値の平均を計算する。 これにより、1ミリリットルあたりのPfuの平均数が得られます。 Ｐｆｕの数は、元の試料中の感染性ファージ粒子の数に対応する。