内皮

角膜内皮は、角膜の最内層を構成し、眼の前房の房水から分離しています(図1)。 61.1). 内皮は、単層（約４μ Ｍ）の扁平上皮細胞からなり、これは、Ｎａ＋／Ｋ＋／Ａｔｐａｓｅのようなイオンポンプおよびｚｏ−１のようなタイトジャンクション蛋白質の明確な発現によ この層は、ポンプリーク機構を介して適切な角膜脱水状態を維持するための障壁として機能する。

角膜内皮細胞（CECs）の喪失または機能不全は、角膜に過剰な体液の蓄積を生じ、進行性の腫脹、間質の混乱、透明性の低下、および視力の障害をもたらす。

角膜内皮細胞（CECs）の喪失または機能不全は、角膜内に過剰な体液の蓄積を生じさせる。 角膜内皮の喪失および機能不全の主な原因は、内皮ジストロフィー、外傷/手術、または慢性前ぶどう膜炎である。 フックスの内皮角膜ジストロフィーおよび先天性遺伝性内皮ジストロフィーは、遺伝的変異および潜在的な環境要因によって引き起こされる最も一般的な角膜内皮ジストロフィーの一つである。 内皮ジストロフィーの別の頻繁な原因、偽性水疱性角化症は、白内障手術中の内皮への損傷によって誘導される。 糖尿病および老化はまたcorneal endothelial損失のための重要な危険率です。

増殖によって修復できる上皮細胞とは異なり、成体CECsは増殖能力が限られている。 その代わりに、内皮細胞は、損傷領域に向かってスライドし、隣接する細胞を拡大することによって修復する傾向がある。 このメカニズムは傷害の後でcorneal endothelial障壁を維持するが、またendothelial細胞密度を減らし、六角形の形態およびポンプ容量を変える。 細胞密度の低下が500-1000細胞/mm2以下の範囲に達すると、利用可能な唯一の治療選択肢は部分的または完全な角膜移植である。 現在、内皮損失のための角膜移植は、米国で行われたすべての角膜移植の60％を占めています。

上記の角膜組織ドナー不足を克服するために、最初の努力は、一次CECsの単離およびex vivo拡張に焦点を当ててきました。

最初の努力は、一次CECsの単離およ ヒトCECsの最初の成功した文化は1965年に報告されました。 それ以来、細胞の限られた増殖能力および培養中のCEC表現型の喪失を克服するために、単離技術、細胞外マトリックス基質、および培地におけるいくつかの修正が開発されている。 例えば、Ｏｋｕｍｕｒａ ｅ ｔ ａ ｌ． 角膜における異なるラミニンアイソフォームの発現を調べ、成人DMにおける優勢なラミニンフォームとしてラミニン-511および521を同定した。 ヒトＣｅｃのｉｎｖｉｔｒｏ培養の基質としてこれら二つのラミニンを用いて，Ｃｅｃの付着，生存および拡張を有意に改善した。 他のグループは基質として人間の提供者得られたDMsの人間CECsを培養することを試みました。 このアプローチの利点は、適切なＣＥＣ維持および成長を達成するためにｉｎ ｖｉｖｏ角膜環境を模倣することである。 Ｃｅｃ拡張を支援する上でのＤＭの重要性は，ウサギ角膜内皮損傷モデルで行われた最近の研究によっても確認された。 これにより，ＤＭの不在はネイティブＣＥＣ遊走および角膜再生を障害することが実証された。

利点にもかかわらず、足場の使用は角膜への送達を複雑にし、精巧な外科的処置を必要とする。 はるかに簡単なアプローチは、細胞懸濁液中でCECsを送達することであろう。 懸濁液中の細胞の注入は、より単純な製造方法を可能にし、理論的には侵襲性が低い。 しかし、このアプローチは、房水の流れによって注入された細胞の除去のリスクを増加させ、角膜における細胞の生存および生着を制限する。 角膜内皮への細胞懸濁液の送達を改善するために開発された二つの方法には、磁場誘導送達の使用およびROCK阻害剤による細胞の共注入が含まれる。 磁気細胞送達のために、Ｃｅｃは、磁性粒子で標識され、外部磁石の助けを借りて後部角膜表面上の適切な位置に送達される。 最近の例では、CECsは超常磁性ナノ粒子で標識され、CEC損傷を有する成人ウサギの前眼室に注入された。 天然のＣＥＣと同様に、注入された細胞は単層を形成し、悪影響なしに角膜透明性を回復させた。 あるいは、Ｏｋｕｍｕｒａ ｅ ｔ ａ ｌ． CECの存続および拡散を高めるのに石の抑制剤Y27632が付いているCecの使用されたcoinjection。 このアプローチは、細胞のより良い生着と角膜損傷のウサギモデルにおける角膜透明性の改善された回復をもたらした。 これらの有益な効果は、ヒトの臨床研究の開始につながる、角膜内皮ジストロフィーのサルモデルで確認されました。 2018では、同じグループは、水疱性角化症の11人の患者において、ROCK阻害剤と組み合わせたCecの移植の結果を報告しました。治療された患者の80％以上が、治療後24週間後に角膜厚の回復と視力の改善を示しました。 本研究は、培養ヒトCECsの低侵襲移植は、角膜内皮機能不全を治療するための新しい治療選択肢として利用することができるという最初の臨床証拠を提 同時に、このアプローチの将来の発展に関する疑問を提起した。 これらには、高品質の移植可能なCECsの生産に適したドナー年齢範囲を決定する必要性、臨床転帰へのROCK阻害剤のメカニズム的貢献、有効性と安全性のバラン さらに、高品質のドナー CECsの限られた可用性とin vitroで拡張する細胞の限られた容量は、このアプローチの臨床翻訳のためのいくつかの重要な課題を一時このため、いくつかのグループは、Msc、皮膚由来細胞、角膜間質細胞、およびPscなどの代替幹細胞源からCEC様細胞を生成しようとしている。 これらの研究は、初代細胞から、このようなNCCsなどの推定CEC前駆集団を単離し、より成熟したCEC様細胞にそれらを分化させることにより、CECsの胚発生の 例えば、角膜間質細胞およびＮｃｃを含有する皮膚由来前駆体を単離し、レチノイン酸およびＧＳＫ３β阻害剤（Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）の存在下で培養して、ＣＥＣ様細胞を誘導した。 これらの細胞は、Pitx2、前眼セグメントの開発のための重要な転写因子だけでなく、CECマーカー Atp1A1とCdh2のアップレギュレーションのupregulationを示した。 重要なことに、細胞はポンプ機能などのCECsの機能的特性を示した。 細胞をキャリアとしてコラーゲンシートを用いて移植したところ，角化症のウサギモデルで視力が回復した。 同様の手法を用いて、Shen et al. 不死化されたヒトCECラインであるB4G12との共培養によって分化した皮膚由来の前駆体。 分化の1週間以内に、細胞は典型的なCECマーカーの顕著な発現を示した。 これらの細胞の移植は、角膜内皮ジストロフィーのウサギとサルの両方のモデルで角膜の厚さと角膜透明性の成功した回復をもたらした。NccはPSCsからin vitroで生成することもでき、臨床応用のための無制限で拡張可能な細胞源を提供する。

NccはPSCsからin vitroで生成することもできます。

Nccは、 張ら ヒト角膜間質細胞とのトランスウェル共培養により，Ｎｃｃのサブタイプである眼周囲間葉前駆細胞（Ｐｏｍｐｓ）へのヒトＥｓｃの分化を報告した。 これらの誘導されたポンポンは、水晶体上皮細胞から馴化培地で培養し、分化は、N-カドヘリン、Foxc1、およびPITX2などの典型的なCECマーカーの遺伝子発現を試験 ＣＥＣ様細胞を濃縮するために，細胞を選別し，脱細胞ブタ角膜マトリックス上に播種し，角膜ジストロフィーのウサギモデルへの移植と角膜修復の誘導を成功させた。

脱細胞角膜からの異種材料の使用を避けるために、最近のアプローチは、CEC細胞の運命を誘導するために低分子化合物とゼノフリー増殖因子を採用 いくつかのグループは、例えば、Ｔｇｆ Β／ＳＭＡＤ経路の阻害後のＰｓｃのＮｃｃへの分化を示している。 次に、これらのＮｃｃを、ＰＤＧＦ−Ｂ ＢおよびＤｋｋ２を含む培地中で培養し、これにより、細胞が六角形の外観を獲得し、ＣＥＣ細胞の分子マーカーを発現するよう誘導された。 重要なことに、細胞はin vitroで生成されたDMを生成するコラーゲンを堆積させることができ、Na+K+Atpasea1などの角膜内皮ポンプ機能の主要なコンポーネントを 有望であるが、これらのPSC由来のCEC様細胞の機能的側面は、さらなる調査を待っています。 いくつかの重要な将来の質問は、漏れ障壁として機能し、角膜の脱水状態を維持するために、これらのPSC由来のCEC様細胞の能力だけでなく、in vivoでの治療