五つのPax-6変異体とsquid胚および成体眼組織におけるその発現パターン
我々は、pygmy squid Pax-6遺伝子（IpPax-6として指定）の単一の3′-RACE PCRを行い、コレオイドにおけるPax-6のスプライシング変異体および複数の遺伝子座を調査した。頭足類 我々は、ピグミー squidには複数の遺伝子座がなかったことがわかったが、我々は離散的な長さの三つのPax-6変異体を同定した。 これらのPax-6変異体の間でアミノ酸配列の違いは、限られた領域に限定されていた。 したがって、彼らは単一の遺伝子座の代替スプライシングイベントの結果であると仮定された。 次に、RT-PCRを用いてスプライシングバリアントの存在を検証し、最終的に本物のPax-6の見かけのオルソログを含む5種類のスプライシングバリアントを得ました(図1)。 本物のIpPax-6の長さと構造は、他のイカ種、Euprymna scolopesとLoligo pealei15、16で見つかったPax-6遺伝子のものと同様であった。 Authentic IpPax-6(authentic form,499aa)は、多くの動物に示されているように、PDおよびHDドメインとc末端P/S/Tリッチドメイン(PST)という二つの独立したDNA結合ドメインを含む(図1)。 タンパク質配列の類似性と系統樹の両方が、IpPax-6がフライeyと脊椎動物Pax-4/6のオルソログであることを確認した（補足図1）。 同定された四つの変異体は、本物のIpPax-6とは異なる長さのタンパク質を産生した（図1）。
ピグミー squidで見つかったスプライシングバリアントの図。
上の行は、squid Pax-6遺伝子の推定されたエクソン-イントロン構造を示しています。 矢印ヘッドは、ゲノムPCR解析および以前の研究でsquid種で確認されたイントロンを示しています。 本物の形（499aa）が最も豊富であり、他のイカ種のPax-6遺伝子に似ています。 変異体1および3は、HDのN末端の半分を符号化するエクソン4を欠いている。 バリアント2と3には、PSTドメインに追加のエクソン、エクソン6があります。 変異体4はまた、PDとHDドメイン間のリンカー領域に20アミノ酸をコードする追加のエクソン3を示しています。
squid Pax-6変異体のステージ特異的発現を探索するために、IpPax-6の追加のエクソンを標的とするように設計されたプライマーを使用して、様々な組織および様々な胚段階でQ-PCRを行った（図2&図S2）。 イカの卵は典型的な軟体動物の幼虫の段階なしでepibolic原腸形成および直接発達を示す17。 胚性眼は、胚盤胞の外胚葉から出現し、ステージ18の後に分化可能であり、網膜色素沈着はステージ20から始まる。 レンズは段階25で肉眼に目に見える透明な棒のような構造として現われます。 我々は最初のすべての五つの変異体をカバーするエクソン2を標的とするプライマーを利用したQ-PCRを行った。 Ｑ−ＰＣＲ分析は、Ｉｐｐａｘ−６が眼小胞形成の前の段階１ ６で発現されたことを示した（図２Ａ）。 IpPax-6の発現強度は、試験された組織の中で最も高い発現強度を示す眼球で、イカ胚の発達とともに徐々にアップレギュレートされた（図2A）。 他の両側動物で観察されるように、IpPax-6の本物と変異型は、筋肉組織における著しく落ち込んだレベルで発現した。 次に、エクソン4を欠いている変異体を標的とするプライマーを利用した（変異体1および3、図2B）。 プライマーは、ステージ16で胚と眼球組織の低レベルで変異体1と3を検出しました。 我々はまた、エクソン6を含む変異体を標的とするプライマーを使用した（変異体2および3、図2C）。 Q-PCR分析は、変異体2および3は、段階16および25で眼球および視神経葉だけでなく、胚で発現したことを示した。 光受容体細胞および水晶体の形成が段階25で胚で始まると、エクソン6を含む変異体は眼の発達に寄与する可能性がある。 結果は、IpPax-6変異体の発現パターンが本物のIpPax-6のそれとは有意に異なっていたことを示しています。
ピグミー squid Pax-6亜種の式。全てのＩｐｐａｘ−６変異体（Ａ）、エクソン４を含まない変異体（変異体１および３）（Ｂ）およびエクソン６を含む変異体（変異体２および３）（Ｃ）の発現レベルを、リアルタ Stage16(1.0)に対する各身体部分の発現レベルを計算し、続いてα-チューブリンの発現レベルに正規化した。 定量は、独立して生成された異なるｃＤＮＡ上で２回実施し、幾何学的手段を計算した。 Y軸は任意です。 誤差バーは標準偏差を表します。 （Ｄ−Ｇ）Ｉｐｐａｘ−６エクソン２（Ｄ、Ｆ）およびＩｐｐａｘ−６エクソン４（Ｅ、Ｇ）のためのアンチセンスＲＮＡプローブを用いた全マウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。 すべての五つの変異体を標的とするエクソン2から設計されたRNAプローブは、ステージ22（D）とステージ25（F）で胚の脳領域全体でPax-6発現を示した。 エクソン２から設計されたＲＮＡプローブはまた、眼の周りのＰａｘ−６発現を示す（Ｄ’、側面図）。 エクソン4標的変異体から設計されたRNAプローブは、本質的にだけでなく、バリアント型2と4は、目（E）の周りの組織を除いて、エクソン2を標的とするプ この結果は、エクソン4欠失を有する変異体（変異体1および3）が、他の変異体（矢頭）と比較して眼の周りの組織に特異的な局在を示すことを示唆している。 スケールバー、10μ m。
各段階に存在する変異体を区別するために、我々はエクソン境界を越えてプライマーセットを利用してRT-PCRを行った。 変異体1は、すべて/いくつかの胚段階で発現されるが、成人の目では発現されないと考えられた（補足図2）。 ＲＴ−ＰＣＲ分析はまた、変異体４が成人の眼、特に網膜において強く発現されたが、レンズにおいては強く発現されなかったことを示した（補足図２Ａ）。 変異体2および3は、すべての胚段階にわたって、および成体組織においても発現された（補足図2B）。IpPax-6変異体の組織特異的発現を同定するために、各変異体に特異的に結合するように設計されたRNAプローブを用いてin situハイブリダイゼーションを行った（図2D-G）。 エクソン2から設計されたRNAプローブは、この研究で同定されたすべての五つの変異体を標的とする。 エクソン4から設計されたRNAプローブは、本物の形態と変異体2および4に結合した。 ＩＰＰＡＸ−６は、ｈａｒｔｍａｎｎらに記載されているように、背側基底葉、上前頭葉、花柄／嗅覚葉および視神経葉を含む脳領域に局在することが見出された（図２Ｄ−Ｇ）。網膜の外側の組織（おそらく将来の虹彩毛様体層に対応する）もまた、段階２ ２でＩｐｐａｘ−６を明確に発現した（図２Ｄおよび２Ｄ’）。 ＩＰＰＡＸ−６発現は、段階２ ５までこの層で観察された。 エクソン4を標的とするプローブを用いたin situハイブリダイゼーションは、変異体2と4が脳内では同様の発現パターンを有していたが、目では同様の発現パターンを有していなかったことを示唆した（図2E）。 この知見は、変異体1と3（エクソン4を欠いている）が目の外層でアップレギュレートされていることを示唆している。 これらの結果は、各IpPax-6変異体が眼形成のプロセスにわたって独立して調節されていることを意味する。
他の頭足類/軟体動物におけるPax-6のエクソン-イントロン構造
我々は、代替スプライシングのこのタイプは、甲殻類頭足類でのみ取得されたかど 日本の槍イカ（Loligo bleekeri）胚RnaにRT-PCR解析を適用すると、眼に代替スプライシング（エクソン4スキップ、エクソン3挿入、エクソン6挿入）に由来する可能性のある三種類のmrnaを発見した（図3A、B）。 挿入されたエクソン3および6はそれぞれ20および40アミノ酸をコードし、スキップされたエクソン4は51アミノ酸をコードした。 他の軟体動物ゲノムにおける同様の代替スプライシングの存在を調査するために、我々はフクロウlimpetと真珠貝におけるPax-6のエクソン-イントロン構造 フクロウリペット（Lottia gigantea、JGIゲノムポータルLotgi v1.0、e_gw1.86.103.1から入手）19および真珠貝（Pinctada fucata、OIST Marine Genomics Unit genome browser P.fucata_ver1.0、transcript:pfu_aug1.0_8418.1_67856から入手）の完全なゲノムシーケンス8418.1)20軟体動物Pax-6は五つのエクソンを持っていることを示した。 イカのエクソン4は、テストされた軟体動物種全体で保存されました。 しかし、エクソン3と5は真珠貝Pax-6遺伝子では見つかりませんでした。 したがって、我々は、変形形態2および4が甲虫類頭足類系統で獲得されていることを発見した（図1）。
IpPax-6変異体で見つかったインデルとHDの予測された3D構造。
ピグミーイカの(a)エクソン3および(B)エクソン6のヌクレオチド配列をそれぞれ整列させた。 比較モデリングに用いたＨ Ｄの翻訳されたアミノ酸配列のアライメント（Ｃ）。 IpPax-6の変異体1および3は、ヘリックス1の一部を欠いている。 相同性モデリングによって得られたスプライスHDの三次元構造（D、D’）。 緑色の棒はIpPax-6のタンパク質を示し、灰色のボールは標的DNA分子を表す。 点線の円は、エクソン4の欠失によって失われたヘリックス1の部分を示しています。私たちの知る限りでは、私たちの研究は、胚の段階に応じて異なって表現されたsquid Pax-6のインフレームスプライシング変異体を報告した最初のものです。 これまでの研究では、他のsquid種15,18でPDドメインのN末端の半分を失っていたスプライシング変異体の離散型を分離したが、これらの変異体は、発現の時空間的な違いを示していませんでした。 我々の研究はまた、代替スプライシングによるPax-6転写物の変異の取得の基礎となるメカニズムが一意に二枚貝などの下の軟体動物は、そのゲノムに対応するエクソン様フラグメントを持っていないように、コレオイド頭足類の系統で取得されていることを示唆した。
squid Pax-6変異体の機能と眼の発達における推定的役割
代替的に使用されるエクソンにコードされるアミノ酸断片の付加および欠失は、IpPax-6タ そのうちの2つ（バリアント1と3）は、本物のPax-6の中央とHDの半分に153merを欠いています（図1）。 欠失がそれらの機能特性に影響を与えるかどうかを調べるために、我々は比較モデリングに基づいてタンパク質の三次元（3D）構造予測を行った。 本物のIpPax-6のHDsの推定3D構造とエクソン3によってコード化されたセグメントを欠いている変異体が構築されました。 鋳型構造はDNA結合型によって同定され、IpPax-6の構造およびDNA結合型の変異体を予測することができた。 本物のフォームの推定3D構造は、合理的によくモデル化されました; コア残基、すなわち、HDの第一ヘリックスの前のループ上のPhe、第一ヘリックス上のLeu、第二ヘリックス上のLeu、およびモデル構造の第三ヘリックス上のTrpとPheは保存され、HDの三つのヘリックスは明らかに互いに密に充填されていた（図3C）。 DNA結合に重要な残基、すなわち、N末端アームの二つのArg残基と第三のヘリックスの表面上の極性残基は、DNA界面に合理的に近い位置に位置していた（図3C、D）。 しかし、変異体の推定的な3D構造は、多くの問題のある問題を提示した。 モデル化された構造では、最初のヘリックスのN末端部分をコードするエクソン3によってコードされた領域の損失は、エクソン2にコードされた15残基 したがって、本物の形態と変異型のアミノ酸配列は、N末端側の15残基を含む領域でのみ異なっていた。 しかし、この違いは変異体の構造エネルギーを有意に増加させ、明らかに全体的な構造を不安定にした。 この不安定性は、第一ヘリックスの前のループ上のPheおよび第一ヘリックス上のLeuの欠如に起因する可能性がある。 これらの成分は三つのヘリックスを充填するために明らかに重要である。 さらに、本物の形態の副溝のDNA塩基に結合するN末端ループの二つのArg残基は、変異体には欠落していた。 変異体における安定性およびＤＮＡ結合におけるこれらの問題は、変異体のＨ Ｄが不安定であり、ドメインがＤＮＡに対してほとんど結合親和性を有さないこ 安定したHDの欠如は、さらに、変異体1および3は、イカ種における本物のIpPax-6のそれとは異なるDNA標的部位を有することを示唆している。
二つの変異体（変異体2と3）もPSTドメイン内に120merの挿入を示しました（図1）。 挿入された配列は、ｓｑｕｉｄに特異的であることが見出された（図２）。 この挿入は、PSTドメインのトランスアクティベーションアクティビティを変更する可能性があります。 変異体４は、ＰＤとＨ Ｄとの間に固有の挿入（５ ７ｍｅｒ）を示した。 Motifプログラム(http://www.genome.jp/tools/motif/)は、挿入されたシーケンスに既知のドメインまたは署名を発見しませんでした。 この挿入は、PDドメインとHDドメイン間のリンカーを伸長させる。