概要
Eyebright、Euphrasia rostkoviana Hayne（Scrophulariaceae）は、伝統的に細菌感染と関連付けることができる結膜炎およびblepharitisのような目の病気を扱う いくつかのEuphrasia種は、以前に精油を含むことが報告されている。 しかし、E.rostkoviana油の組成および生物活性は不明である。 Ｅｔｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓの眼感染症に関連するいくつかの生物に対するアイブライトエッセンシャルオイルの化学組成と抗菌活性を調べた。 GC-MS分析は、チモール（7.97％）、ミリスチン酸（4.71％）、リナロール（4.65％）、およびアネトール（4.09％）に続いて主成分としてn-ヘキサデカン酸（18.47％）で、70以上の成分を明らかにした。 精油は緑膿菌を除いて試験したすべての生物に対して抗菌効果を示した。 最もよい活動は512μ g/mLの最低の抑制的な集中とテストされるすべてのグラム陽性の細菌に対して観察されました。 これは、E.rostkoviana精油の化学組成およびその抗菌活性に関する最初の報告である。
1. はじめに
アイブライト、Euphrasia rostkoviana Hayne（Scrophulariaceae）は、様々な病気の治療のための伝統的な薬として何世紀にもわたってヨーロッパで使用されてきました。 乾燥した咳、嗄声、寒さ、耳痛、頭痛の対症療法、花粉症、化膿性皮膚病変、腸管のカタル性疾患に対して、特に結膜炎、眼瞼炎、眼疲労、化膿性眼炎、stiesなどの眼疾患の治療-予防のための洗眼剤として使用されている。 Eyebrightの茶の使用はまた牛目の伝染の処置のためのethnoveterinary薬で報告されました。 目の病気の治療のための伝統的な使用の世紀にもかかわらず、結膜炎の治療におけるユーフラシア点眼薬の有効性を確認する前向きコホート試験と、新生児の抗生物質消費に対する点眼薬の局所適用の効果を調査する単一の臨床試験が行われている。 さらに、いくつかのEuphrasia抽出物の抗カンジダおよび抗菌活性に関する最近の報告まで、抗菌作用のスペクトルは完全に知られていなかった。
Eの治療効果。 rostkovianaは、主にその抗酸化、抗炎症、および抗菌活性に起因する可能性があります。 以前にE.rostkoviana抽出物で同定された化合物の中で、アピゲニン、ルテオリン、ケンフェロール、ケルセチン、カフェ酸、クマリン酸、およびロスマリン酸は、抗菌作用を担 E.officinalis l.およびE.stricta Kuntにおける精油（EO）の存在は以前に報告されているが、E.rostkoviana EOの組成および生物活性は不明である。 そこで本研究では，三つのグラム陽性菌（Enterｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ，ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）と三つのグラム陰性菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）と一つの酵母（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）のパネルに対するアイブライトＥＯの化学組成と抗菌活性を調べた。
2. 材料および方法
2.1. 化学物質および植物材料
eo成分同定のための本物の基準borneol、樟脳、carvacrol、carvone、caryophyllene、p-cymene、estragole、eucalyptol、limonene、linalool、menthol、menthone、β-myrcene、γ-terpinene、およびthymol、ならびに対照抗生物質ciprofloxacinおよびtioconazoleは、Sigma-Aldrich（Prague、Czech Republic）から購入した。 溶媒として、ヘキサン（Ｍｅｒｃｋ，Ｐｒａｗａ，ｃｚａｋｙ Ｒｅｐａｎｄ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌａｃｈ−Ｎｅｒ，Ｎｅｒａｔｏｖｉｃｅ，ｃｚａｋｙ Ｒｅｐａｎｄ）、及びＴｗｅｅｎ８ ０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｒａｗａ，ｃｚａｋｙ Ｒｅｐａｎｄ）を使用した。 ＥＯ蒸留に使用された植物材料は、市販の供給源（ｆ−ＤＥＮＴＡＬ、ｈｏｄｏｎｉｎ、チェコ共和国）から購入した。 クレベンジャー型装置を用いた水素化蒸留によりＥＯを抽出した。
2.2. Ｅ．ｒｏｓｔｋｏｖｉａｎａ ＥＯは、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）製のＨＰ−５ＭＳカラム（３ ０ｍ×０． ヘキサンを溶媒として使用し、1μ lのサンプル体積を分割モード（比20：1）で250℃に加熱されたインジェクタに注入した。 ヘリウムは1mL/分の流量のキャリアガスとして使用された。 MS分析はフルスキャンモードで行い、電子イオン化エネルギーを70eVに設定した。 個々の成分の同定は、それらの質量スペクトルおよび相対保持指数のＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ ｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＮＩＳＴ、ＵＳＡ）および文献との比較、ならびに本物の標準のコインジェクショ2.3.
細菌株および培養培地
三つのグラム陽性細菌Enterococcus faecalis ATCC29212、黄色ブドウ球菌ATCC29213、およびSの標準株。 ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＴＣＣ１ ２ ２ ２ ８、３つのグラム陰性菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２ ５ ９ ２ ２、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ７ ０ ０ ６ ０ ３、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ２ ７ ８ ５ ３、並びに１つの酵母Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ１ ０ ２ ３ １をオキソイド（Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手した。 カチオン調整Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ（Ｍ Ｈ Ｂ）およびＳａｂｏｕｒａｕｄ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ（ＳＤＢ）を、それぞれ抗菌および抗真菌マイクロ希釈アッセイのための培養培地として使用し、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒａｗａ、ｃｚｅｋｏ Ｒｅｐｐａｒｃ）で平衡化した。 Ｍｕｅｌｌｅｒ-Ｈｉｎｔｏｎ寒天（ＭＨＡ）とｓａｂｏｕｒａｕｄｄｅｘｔｒｏｓｅ寒天（ＳＤＡ）をそれぞれ殺菌濃度と殺菌濃度のその後の定量に使用した。 全ての媒体は、Ｏｘｏｉｄ（Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から購入した。2.4.
最小阻害濃度（MIC）決定
Micは、96ウェルマイクロタイタープレートを使用して天然物の抗感染可能性の効果的な評価のために提案された勧告に従って修正された臨床および実験室標準研究所（CLSI）のガイドラインに従ってin vitroブロスマイクロ希釈法を用いて決定された。 簡潔に述べると、ＥｏをＴｗｅｅｎ８ ０を添加してＤＭＳＯに溶解し、２倍の連続希釈液を細菌用Ｍ Ｈ Ｂおよび酵母用ＳＤＢで調製したが、試験した濃度は４〜２ ０ ４ ８μ ｇ／ｍｌであった。 マイクロプレート中の初期ＣＦＵ濃度が細菌および酵母についてそれぞれ５×１ ０ ５および２×１ ０ ３ＣＦＵ／ｍＬであるように、接種物を一晩培養から調製した。 接種されたプレートは、C.albicansの場合には24時間のインキュベーションの後に35℃で、もう一度48時間後に調べた。 微生物増殖を、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）によって４ ０ ５ｎｍで分光光度測定した。 ＭＩＣは、陽性増殖対照と比較して細菌増殖の≧８ ０％を阻害することができる最低濃度として表現された。 実験は三つの独立したテストで三重で行われ、中央値はMICs計算のために使用されました。 隣接する井戸の微生物成長のEOの揮発部品の影響の最近報告された可能性が原因で、最終的な成長の影響を検出するために肯定的な成長制御列はEOの希薄の列の間に挿入されました。 使用した溶媒は、試験した濃度での細菌増殖を阻害しなかった。 細菌と酵母の基準抗生物質としてシプロフロキサシンとチオコナゾールをそれぞれ使用した。2.5.
最小殺菌濃度（MBC）と最小殺菌濃度（MFC）の決定
20μ lのアリコートは、それぞれ、テストされた細菌と酵母のインキュベーションの24時間と48時間後にmhaプレート（C.albicansのSDAプレート）に微生物増殖せずに各ウェルから転送されました。 ＭＢＣおよびＭＦＣは、接種物と比較して、ＣＦＵの≧９ ９．
3. 結果と議論
3.1. 油および生物活性画分成分の化学的特性評価
クレベンジャー型装置によるEO水素化蒸留は、おそらく脂肪酸の割合が高い（合計で32.23％）によって引き起こ EOのGC-MS分析では、パルミチン酸（18.47％）が最も豊富な成分であり、チモール（7.97％）、ミリスチン酸（4.71％）、リナロール（4.65％）、アネトール（4.09％）、リノレン酸（3.81％）、ヘキサヒドロファルネシルアセトン（3.16％）、ラウリン酸（2）が最も豊富な成分であることが明らかになった。79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.
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| R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: 確実なサンプルのcoinjectionに基づく同一証明;d:暫定的な同一証明。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. 抗菌活性
E. rostkoviana EOは、512から2048μ g/mLの範囲のMICsで試験された七つの生物のうち六つに対する活性を示した。 グラム陽性菌はグラム陰性菌および酵母よりも感受性が高かったが，緑膿菌は試験した最高濃度で油によって阻害されなかった唯一の生物であった。 試験したすべての微生物に対するＥＯのＭｉｃ、Ｍｂｃ、およびＭｆｃを表２に要約する。 活性濃度は、例えば、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｍｅｎｔｈａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｍｙｒｔｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ、または尋常性胸腺のＥｏｓについて、特に抗カンジダ活性の場合に以前に報告されたものと同等である。 この油は，Ｅ．ｃｏｌｉ，ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ，ｓ．ａｕｒｅｕｓ，およびｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対してＴｅｉｘｅｉｒａおよびＳｉｌｖａによって試験されたＥ．ｒｏｓｔｋｏｖｉａｎａ抽出物よりも有効であった。 Eに影響を受けやすい細菌や酵母に対する基準抗生物質のマイク。 rostkoviana EOは、それぞれCLSI許容限界および以前の報告に従っていた。
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| The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
主要なEO構成パルミチン酸の含有量は20％を超えず、1-8％の範囲の他の10以上の抗菌活性化合物があるため、E.rostkoviana EO抗菌効果を担う主な薬剤を示唆することは困難である。 パルミチン酸は、グラム陰性ではあるがグラム陽性ではない細菌に対して活性な画分の主要な化合物として以前に同定されている。 一方、中鎖飽和脂肪酸および長鎖不飽和脂肪酸は、特にグラム陽性菌を阻害することが知られている。 また、ラウリン酸は、真菌の数に対しても活性を発揮します。 従って、ＥＯの抗菌活性は、おそらく、抗菌脂肪酸と、ＥＯ中で同定された他の周知の抗菌化合物、例えば、アネトール、ボルネオール、樟脳、カルバクロール、リナロール、メントール、α−テルピネオール、またはチモールとの複合作用によるものである。
4. 結論
結論として、化学分析は、Eに存在する抗菌活性物質の数を明らかにした。 ｒｏｓｔｋｏｖｉａｎａｅｏおよびグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する抗真菌および抗菌活性を確認した。 我々の知る限りでは、これはE.rostkoviana EOの組成および抗菌活性に関する最初の報告である。
利益相反
著者らは、この論文の出版に関して利益相反はないと宣言しています。
謝辞
この作品は、欧州科学財団とチェコ共和国プロジェクトCZの教育、青少年、スポーツ省によって財政的に支援されました。1.07/2.3.00/30.0040; チェコ共和国の教育、青少年、スポーツ省のS-助成金によって、およびチェコ生命科学プラハプロジェクトIGA20155012のチェコ大学によって。 著者は英語の校正のためにSlavka Barlakovaに感謝しています。