HPV/p16正 ヒト腫瘍試料を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈ Hospitalsｉｔａｌｓ Ｌｅｕｖｅｎ（Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）の倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って取得し、すべての患者の暗黙の同意を得た。 臨床病理学的データは、患者のチャートから抽出され、平均フォローアップ時間は4.19年であった。 HPV陽性患者は、t1/2期腫瘍を示すHPV陽性患者の45％（58のうち26;p=0.025）でより低いT期を特徴としたが、HPV陰性群では29％（175のうち51;p=0.025）であった。 また、HPV陽性腫瘍は有意に高かった（p=0。Ｎ２／Ｎ３腫瘍を示すＨＰＶ陽性患者の７ ２％（５ ８のうち４ ２）との結節性の関与に対し、これは、ＨＰＶ陰性群ではわずか５ ４％（１ ７ ５のうち９ ５）であった。 P16状態とN段階との関係は有意ではなかったが、より高い結節関与とp16陽性への傾向が見られた。 P16陽性患者の六十から三％がN2/N3腫瘍を示したが、これはp16陰性群ではわずか54％であった（表1）。 これらの結果は他の研究と一致しており、HPV陽性HNSCC患者はより高いN期およびより低いT期を有することを示している。

予想されるように、低いTステージは、5年間の制御率83％および70％（p=0.04）T1/T2およそれぞれt3/4腫瘍（追加ファイル1：図s1a）。 N2/3腫瘍（5年DC率70％；p=0.02）は、N0/1腫瘍（5年DC率85％；p=0.02）と比較して遠隔障害のリスクが高いことを示した（追加ファイル1：図S1B）。 ＨＰＶ陽性疾患と陰性疾患の間のＤＣ率に統計学的に有意な差は見られなかった（それぞれ５年ＤＣ率８ ２％対５年ＤＣ率７ ２％；ｐ＝０． 有意ではないが、DC率のこの10％の差は、局所腫瘍制御を超えたウイルスの影響を示唆している。 さらに、それはHPVの肯定的な、否定的なHNSCC間の異なった普及パターンの存在を示します。

p16は、HPV陽性HNSCCの浸潤と移動能力を抑制します

私たちの患者のコホートにおける転移で見られるこれらの電位差の背後にある分子機 ＨＰＶ／ｐ１ ６陽性のＳＣＣ１ ５ ４およびＳＣＣ１ ０ ４細胞は、ＨＰＶ／ｐ１ ６陰性のＳＱＤ９、ＣＡＬ２ ７およびＳＣ２ ６ ３細胞と比較して有意に低い遊走速度を示した（図１）。 1a）。 遊走アッセイと一致して、ＨＰＶ／ｐ１ ６陽性細胞は、ＨＰＶ／ｐ１ ６陰性細胞と比較して減少した浸潤能力を示した（図１）。 1b）。

腫瘍サプレッサー p16は、HPV陽性HNSCCのためのよく知られている細胞周期調節因子であり、良好なサロゲートマーカーである。 さらに、最近のデータは、移行および血管新生の抑制における役割を含む、p16のためのより広範な役割を帰する。 したがって、我々はまた、p16（shp16）とコントロールshRNA（shluc）のための短いヘアピンRNA（shRNA）で操作HPV陽性SCC154細胞の遊走と侵入能力にp16の影響を調べた。 P16発現のダウンレギュレーションは、SCC154細胞の遊走および侵入能力を増加させた（図。 およびｄ）。 これらのデータは、HPV正と負のHNSCCの間の普及パターンの違いの存在を確認し、転移カスケードにおけるp16の積極的な役割を示唆しています。

p16は、HPV陽性HNSCCにおける血管新生を介した遊走および浸潤を抑制する

血管内皮増殖因子A（VEGFA）などの血管新生因子によって癌細胞で積極的に持続する血管新生は、癌細胞の広がりおよび転移の導管であり、積極的な腫瘍進行を促進することがよく知られている。 さらに、ＨＰＶ／ｐ１ ６とＶＥＧＦＡとの間の負の相関は、ＨＮＳＣＣにおいて以前に記載されている。 したがって、我々は患者コホートにおけるHPV、p16およびVEGFAとの間の関係を評価した。 HPV陽性患者は、HPV陰性群の32％（161のうち53）と比較して、VEGFA発現を示さないまたは低い患者の54％（51のうち28）で有意に低いVEGFA発現を示した（表2）。 ＶＥＧＦ Αとｐ１ ６との間の負の相関はあまり顕著ではなかったが、有意性への傾向が見られた（表２）。

我々はさらに、shp16またはshlucで操作SCC154HPV陽性細胞を注入したin vivo異種移植片….. 対照腫瘍と比較して、p16発現が低いマウス腫瘍において、より多くの血管が検出された（図10B）。 2a）。 さらに、血管新生の増加は、壊死の減少、有糸分裂細胞の数の増加、およびｓｈｐ１ ６発現腫瘍の増殖の利点をもたらした（追加ファイル２：図Ｓ２Ａ〜Ｃ）。 我々は、転移性動物モデルの不在のためにin vivoでの転移の抑制におけるp16の関与を検証することができませんでした。 しかし、shp16マウス腫瘍で見られる成長の利点と増加した血管新生は、HPV陰性HNSCC患者における高度なT段階の頻繁な発生を説明することができます。

p16は、HPV陽性HNSCCにおけるリンパ管形成および結節広がりを刺激します

これらの結果は、HPV/p16陽性および陰性HNSCC患者における同様の遠隔再発率の発生を説明するものではなく、HPV/p16陽性および陰性hnscc患者における同様の遠隔再発率の発生を説明するものではなく、確かにHPV間の非常に有意な関連性を説明するものではありません。陽性および結節の関与は、我々および他のいくつかの研究に記載されている。 これは、ＨＰＶ陽性Ｈ ＮＳＣＣにおける高い局所転移電位の存在を関与させるので、特に重要である。 興味深いことに、リンパ管形成は、血管形成と同様に、腫瘍内の新しいリンパ管の成長を誘導し、リンパ節への細胞輸送を増強することによって腫瘍metastasisを促進する。 さらに、腫瘍におけるリンパ管密度の増加は、リンパ節への転移の増加と関連している。 . したがって、我々はshlucとshp16マウス腫瘍における同族体リンパ管ヒアルロン酸（LYVE-1）免疫染色によってリンパ管形成を評価した。 本発明者らは、p16抑制が、転移におけるp16の二重の役割を示唆するHPV/p16陽性異種移植片におけるリンパ管密度の低下をもたらすことを見出し 2b）。

p16の機能を理解するために、これらのタンパク質は血管新生およびリンパ管新生の重要な調節因子として受け入れられているため、インテグリンに焦点を当てた。 さらに、インテグリンへのp16の結合および細胞拡散の損失は以前に文書化されている。 Α4β1などのインテグリンは、リンパ管形成の重要な調節因子である。 したがって、我々はscc154shlucとSCC154shp16マウス腫瘍におけるalpha4beta1インテグリンの存在を評価した。 Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).