Cinco variantes de Pax-6 y sus patrones de expresión en embriones de calamar y tejidos oculares adultos

Realizamos una única PCR DE 3’de RAZA para el gen Pax-6 de calamar pigmeo (designado como IpPax-6) para investigar las variantes de empalme y múltiples loci de Pax-6 en cefalópodos coleoides. Encontramos que no había múltiples loci en el calamar pigmeo, pero identificamos tres variantes Pax-6 de longitudes discretas. Las diferencias en las secuencias de aminoácidos entre estas variantes de Pax-6 se limitaron a regiones limitadas. Por lo tanto, se hipotetizó que eran el resultado de eventos de empalme alternativos de un solo lugar. A continuación, validamos la presencia de variantes de empalme utilizando RT-PCR y finalmente obtuvimos cinco tipos de variantes de empalme, incluida una ortología aparente de Pax-6 auténtico (Figura 1). La longitud y estructura del auténtico IpPax – 6 eran similares a las de los genes Pax-6 encontrados en otras especies de calamar, escolopos Euprimna y Loligo pealei15,16. El IpPax-6 auténtico (forma auténtica, 499 aa) comprende dos dominios independientes de unión al ADN, los dominios PD y HD y un dominio rico en P/S/T (PST) de terminal C, que es el activador dedicado con una proteína transactivadora asociada, como se muestra en muchos animales (Figura 1). Tanto la similitud de secuencias proteicas como el árbol filogenético confirmaron que IpPax – 6 era un ortólogo de mosca ey y de vertebrados Pax-4/6 (figura suplementaria 1). Las cuatro variantes identificadas produjeron proteínas con longitudes diferentes de las del auténtico IpPax-6 (Figura 1).

Para explorar la expresión específica de la etapa de las variantes Pax-6 de calamar, realizamos Q-PCR para varios tejidos y en varias etapas embrionarias utilizando cebadores diseñados para apuntar a los exones adicionales de IpPax-6 (Figura 2 & Figura S2). Los huevos de calamar presentan gastrulación epibólica y desarrollo directo sin etapas larvarias típicas de moluscos 17. Los ojos embrionarios aparecen a partir de la epidermis externa del blastodisco y son diferenciables después de la etapa 18, con pigmentación retiniana a partir de la etapa 20. La lente aparece como una estructura transparente en forma de palo visible a simple vista en la etapa 25. Primero realizamos Q-PCR utilizando cebadores dirigidos al exón 2, que cubre las cinco variantes. El análisis Q-PCR mostró que el IpPax – 6 se expresó en el estadio 16 antes de la formación de vesículas oculares (Figura 2A). La intensidad de expresión de IpPax-6 se reguló gradualmente con el desarrollo del embrión de calamar (Figura 2A), y el globo ocular mostró las intensidades de expresión más altas entre los tejidos analizados. Como se observó en los otros animales bilaterianos, las formas auténticas y variantes de IpPax-6 se expresaron en niveles marcadamente deprimidos en el tejido muscular. A continuación, utilizamos cebadores dirigidos a variantes que carecen de exón 4 (variantes 1 y 3, Figura 2B). Los cebadores detectaron variantes 1 y 3 a niveles bajos en los embriones en la etapa 16 y en el tejido del globo ocular. También utilizamos cebadores dirigidos a variantes, incluido el exón 6 (variantes 2 y 3, Figura 2C). El análisis Q-PCR mostró que las variantes 2 y 3 se expresaban en los globos oculares y lóbulos ópticos, así como en embriones en las etapas 16 y 25. A medida que la formación de células fotorreceptoras y el cristalino comienza en los embriones en la etapa 25, las variantes que incluyen el exón 6 pueden contribuir al desarrollo del ojo. Los resultados demuestran que los patrones de expresión de las variantes IpPax-6 diferían significativamente de los del auténtico IpPax-6.

Para distinguir qué variantes están presentes en cada etapa, realizamos RT-PCR utilizando conjuntos de imprimación a través de los límites de exones. Se consideró que la variante 1 se expresaba en todas / algunas etapas embrionarias, pero no en los ojos adultos (figura complementaria 2). El análisis RT-PCR también mostró que la variante 4 estaba fuertemente expresada en los ojos adultos, particularmente en la retina, pero no en los lentes (figura suplementaria 2A). Las variantes 2 y 3 se expresaron en todos los estadios embrionarios y también en tejidos adultos (figura suplementaria 2B).

Para identificar la expresión tisular específica de las variantes IpPax-6, realizamos hibridación in situ utilizando sondas de ARN diseñadas para unirse específicamente a cada variante (Figura 2D–G). La sonda de ARN diseñada a partir del exón 2 se dirige a las cinco variantes identificadas en este estudio. La sonda de ARN diseñada a partir del exón 4 unido a la forma auténtica y a las variantes 2 y 4. Se encontró que el IpPax-6 estaba localizado en el área cerebral, incluyendo el lóbulo basal dorsal, el lóbulo frontal superior, los lóbulos pedúnculo/olfatorio y los lóbulos ópticos (Figura 2D–G), como se describe en Hartmann et al.18 El tejido exterior de la retina (tal vez correspondiente a la futura capa de iridóforo) también expresó claramente IpPax-6 en la etapa 22 (Figuras 2D y 2D’). La expresión de IpPax-6 se observó en esta capa hasta el estadio 25. La hibridación in situ utilizando la sonda dirigida al exón 4 sugirió que las variantes 2 y 4 tenían patrones de expresión similares en el cerebro, pero no en los ojos (Figura 2E). Este hallazgo sugiere que las variantes 1 y 3 (que carece del exón 4) se reguló en la capa externa de los ojos. Estas consecuencias implican que cada variante IpPax-6 se regula de forma independiente a través de los procesos de formación ocular.

Estructura exón-intrón de Pax-6 en otros cefalópodos/moluscos

Investigamos si este tipo de empalme alternativo se adquirió solo en cefalópodos coleoides. Aplicando el análisis de RT-PCR a ARN embrionarios de calamar lanza japonés (Loligo bleekeri), encontramos tres tipos de ARN MR posiblemente derivados de empalmes alternativos (salto del exón 4, inserción del exón 3 e inserción del exón 6) en los ojos (Figura 3A, B). Los exones 3 y 6 insertados codifican 20 y 40 aminoácidos, respectivamente, mientras que el exón 4 omitido codifica 51 aminoácidos. Para estudiar la presencia de empalmes alternativos similares en otros genomas moluscos, examinamos las estructuras exón-intrón de Pax-6 en la lapa de búho y la ostra perla. La secuencia completa del genoma de la lapa de búho (Lottia gigantea, obtenida del portal genómico JGI Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 y de la ostra perla (Pinctada fucata, obtenida del navegador genómico de la Unidad de Genómica Marina de la OIST P. fucata_ver1.0, transcripción: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, andamio 8418.1) 20 mostró que el molusco Pax-6 tiene cinco exones. El exón 4 del calamar se conservó en todas las especies de moluscos analizadas. Sin embargo, los exones 3 y 5 no se encontraron en el gen Pax-6 de pearl oyster. Así, encontramos que las formas variantes 2 y 4 se han adquirido en el linaje de cefalópodos coleoides (Figura 1).

A nuestro leal saber y entender, nuestro estudio es el primero en reportar variantes de empalme en el marco del calamar Pax-6 que se expresaron de manera diferente según la etapa embrionaria. Estudios previos aislaron tipos discretos de variantes de empalme que habían perdido la mitad N-terminal del dominio PD en otras especies de calamar15,18, pero estas variantes no mostraron diferencias espacio-temporales en la expresión. Nuestro estudio también sugirió que los mecanismos subyacentes a la adquisición de variaciones en las transcripciones de Pax-6 mediante empalmes alternativos se han adquirido de manera única en el linaje de cefalópodos coleoides, ya que los moluscos inferiores, como los bivalvos, no poseen un fragmento similar a un exón correspondiente en sus genomas.

Función de las variantes Pax-6 de calamar y su papel putativo en el desarrollo ocular

Se espera que la adición y eliminación de un fragmento de aminoácido codificado en los exones utilizados alternativamente cause cambios estructurales en las variantes de proteínas IpPax-6, que pueden alterar su función en el proceso de desarrollo. Dos de sus variantes (variantes 1 y 3) carecen de un 153mer en medio del Pax-6 auténtico y la mitad del HD (Figura 1). Para explorar si la deleción influye en sus propiedades funcionales, realizamos predicciones estructurales tridimensionales (3D) de las proteínas basadas en modelos comparativos. Se construyeron las supuestas estructuras 3D del HDs del auténtico IpPax-6 y la variante que carecía del segmento codificado por el exón 3. La estructura de la plantilla fue identificada por la forma unida al ADN para que pudiéramos predecir la estructura del IpPax-6 y la variante en forma unida al ADN. La supuesta estructura 3D de la forma auténtica estaba razonablemente bien modelada; los residuos del núcleo, a saber, Phe en el bucle anterior a la primera hélice del HD, Leu en la primera hélice, Leu en la segunda hélice y Trp y Phe en la tercera hélice de la estructura del modelo, se conservaron y las tres hélices del HD estaban aparentemente apretadas entre sí (Figura 3C). Los residuos importantes para la unión al ADN, a saber, dos residuos de Arg en el brazo terminal N y residuos polares en la superficie de la tercera hélice, estaban situados razonablemente cerca de la interfaz del ADN (Figura 3C, D). Sin embargo, la supuesta estructura 3D de la variante presentaba una serie de problemas. En la estructura modelada, la pérdida de la región codificada por el exón 3, que codifica la parte N-terminal de la primera hélice, fue compensada por 15 residuos codificados en el exón 2. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las formas auténtica y variante diferían solo en la región que contenía los 15 residuos del lado N-terminal. Esta diferencia, sin embargo, aumentó significativamente la energía estructural de la variante y aparentemente desestabilizó la estructura general. Esta inestabilidad puede ser el resultado de la falta de Phe en el bucle anterior a la primera hélice y de Leu en la primera hélice. Estos componentes son evidentemente importantes para embalar las tres hélices. Además, dos residuos de Arg en el bucle N-terminal que se unen a las bases de ADN en el surco menor en la forma auténtica faltaban en la variante. Estos problemas de estabilidad y unión al ADN en la variante sugieren fuertemente que la EH de la variante es inestable y que el dominio tiene poca afinidad de unión al ADN (Figuras 3D y 3D’). La falta de una EH estable sugiere además que las variantes 1 y 3 tienen diferentes sitios de destino de ADN de los del auténtico IpPax-6 en especies de calamar.

Dos variantes (variantes 2 y 3) también exhibieron una inserción de 120 mer dentro del dominio PST (Figura 1). Se encontró que la secuencia insertada era específica del calamar (Figura 2). Esta inserción puede cambiar las actividades de transactivación del dominio PST. La variante 4 mostró una inserción única (57 mer) entre el PD y el HD. El programa Motif (http://www.genome.jp/tools/motif/) no encontró dominios ni firmas conocidos en la secuencia insertada. Esta inserción alarga un enlazador entre los dominios PD y HD.