El receptor de andrógenos (AR) es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares de hormonas esteroides que incluye receptores de estrógeno, progestina, glucocorticoides y mineralocorticoides.1 La unión de la testosterona andrógena prototípica producida endogenéticamente (1) y el importante metabolito activo dihidrotestosterona (2) a AR inicia una variedad notablemente diversa de actividades biológicas que pueden variar según el sexo, la edad y el estado hormonal de un sujeto. La actividad de la RA es fundamental para el desarrollo y la función sexuales normales de los seres humanos, pero más allá de este papel característico, la activación de la RA también tiene efectos importantes en diversos objetivos, como los huesos, el hígado, los músculos y el sistema nervioso central.2,3 El potencial terapéutico de la señalización de andrógenos es bien apreciado en la comunidad de la química medicinal, y durante bastante tiempo, los químicos han buscado compuestos que estimulen selectivamente el crecimiento muscular y óseo al tiempo que minimizan los efectos proliferativos y/o hipertróficos en los tejidos sexuales, como la próstata en los hombres y el clítoris en las mujeres.4,5 Tales compuestos se han denominado moduladores selectivos del receptor de andrógenos o SARM. En este sentido, el andrógeno prototípico y endógeno, la testosterona, se considera un comparador de referencia lógico. El compuesto 3 es el GTx SARM S-22 y el compuesto 4 es el BMS SARM 562929, ambos de los cuales se han reportado en la literatura como compuestos activos por vía oral con selectividad para el músculo sobre la próstata en relación con la testosterona en varios modelos preclínicos.6,7
La posibilidad de obtener compuestos que tengan actividades selectivas de tejidos que sean diferentes de las de la testosterona de referencia endógena podría derivarse del hecho de que la activación típica del receptor AR, que se inicia mediante la unión de una molécula con afinidad por la AR al dominio de unión del ligando AR, es seguida por una serie: Estos pueden incluir un cambio en la topología del receptor, disociación de proteínas de choque térmico, dimerización del receptor, fosforilación del receptor, eventos de señalización rápida, translocación al núcleo (AR), asociación con muchas proteínas correguladoras diferentes para formar un complejo transcripcional que resulta en la activación o supresión de la síntesis de ARN de genes modulados por AR, y finalmente degradación del receptor.8 Dado que cada topología del complejo receptor-ligando es única para esa estructura de ligando, se puede apreciar que la interacción de cualquier complejo receptor−ligando en particular con proteínas correguladoras es probable que también sea única para ese ligando. Además, debido a que el nivel de expresión de AR, la constelación y el nivel de expresión de proteínas correguladoras, y los patrones de eventos reguladores post-transcripcionales difieren en cada tipo de célula diana de andrógenos, y la topografía de los sitios reguladores de AR en el genoma difiere en cada gen, esta notable coreografía de eventos e interacciones proporciona un entorno rico dentro del cual uno podría buscar SARM que tengan un patrón deseable de farmacología selectiva de tejidos, como una alta actividad anabólica pero androgénica limitada.
Complicando aún más nuestra comprensión del origen de la selectividad SARM es la «bioamplificación» de la testosterona androgénica endógena primaria. Curiosamente, la testosterona andrógena producida endógenamente y muy importante sirve como un tipo de «anti-SARM» o «SARM inverso» porque su actividad androgénica aumenta mediante la conversión a la 5α-dihidrotestosterona más potente por la enzima 5α-reductasa en ciertos tejidos, incluidos el cuero cabelludo y la próstata (pero no en los músculos o los huesos). Como resultado, los andrógenos que no se someten a tal bioamplificación en la próstata demostrarán una mejor selectividad con respecto al músculo frente a la próstata en comparación con un control tratado con testosterona o un animal intacto cuyo andrógeno endógeno primario es la testosterona.9 En términos más generales, uno podría apreciar que las diferencias metabólicas entre andrógenos endógenos como la testosterona o la dihidrotestosterona y los SARM también pueden dar fe de al menos algunas diferencias de selectividad.
Nuestro trabajo en el área de SARM resultó en la síntesis y evaluación de un gran número de plantillas de candidatos. Si bien nos pareció relativamente fácil obtener compuestos con alta afinidad por la RA, luchamos por lograr compuestos que demostraran una buena eficacia oral y una alta tolerabilidad in vivo. Después de escanear muchas pistas potenciales para la actividad oral in vivo, llegamos al compuesto de alta afinidad 5 a través de una combinación de pruebas intermedias sintéticas, evaluación de literatura y combinación de fragmentos. Quedamos encantados cuando 5 demostraron actividad oral en ratas.
Sin embargo, cuando realizamos un análisis farmacocinético en ratas, solo pudimos detectar niveles muy bajos de 5 después de la administración oral (F < 5%). Análisis posteriores revelaron que 5 se convirtió eficientemente a 6in vivo, presumiblemente por citocromos P450 en el hígado de rata.10 El compuesto 6 tuvo una actividad similar al compuesto 5 en vivo, lo que sugiere que el 6 fue en gran parte responsable de la actividad del compuesto 5.11 Una pantalla in vitro con microsomas humanos reveló un metabolismo rápido del compuesto 5, lo que indica que esta transformación es una posible responsabilidad metabólica humana y nos lleva a preparar compuestos en los que la posición 4’del fenilo colgante se bloquea de la hidroxilación inducida por el P450.12 Observamos varios análogos que contenían un grupo de bloqueo de 4′, y en el curso de nuestros esfuerzos identificamos el compuesto 7 (RAD140; Figura Figure1)1) como nuestro candidato a desarrollo preclínico.
Estructuras de testosterona (1), 5α-dihidrotestosterona (2), GTx S-22 (3), BMS 562929 (4), plomo inicial 5, metabolito activo 6 y 7 (RAD140).
La síntesis del compuesto 7 se muestra en el Esquema 1.13, 14 Nos basamos en una sustitución rápida de ipso-flúor del precursor del lado izquierdo, pieza 8, con d-treonina en presencia de K2CO3 en DMSO para dar el producto deseado 9 en rendimientos viables (típicamente >50%). El aducto 9 de d-Thr se acopló con 4-cianobenzohidrazida en condiciones de acoplamiento estándar utilizando EDCI y HOBt. El producto resultante 10 se sililó con TBDMS-Cl, se sometió a condiciones de ciclización deshidratante en presencia de TPP / I2, y luego se desilió para el paso final.15-17 En general, esto ha demostrado ser una síntesis confiable y eficiente utilizando un aminoácido bastante barato, aunque no teogénico, como fuente quiral.
La estabilidad de RAD140 fue alta (t1 / 2 > 2 h) en incubaciones con microsomas de rata, mono y humano, y también tuvo buena biodisponibilidad en ratas (F = 27-63%) y monos (65-75%). RAD140 demostró una excelente afinidad por el receptor de andrógenos (Ki = 7 nM frente a 29 nM para la testosterona y 10 nM para la DHT), así como una buena selectividad sobre otros receptores nucleares de hormonas esteroides, siendo el receptor diana más cercano el receptor de progesterona (IC50 = 750 nM frente a 0,2 nM para la progesterona).18 La actividad de los agonistas andrógenos funcionales in vitro se confirmó en el ensayo de diferenciación de osteoblastos C2C12, en el que se demostró una CE50 de 0,1 nM (DHT = 0,05 nM).19
RAD140 se caracterizó en una serie de ensayos in vivo para determinar su eficacia oral en una serie de parámetros asociados con la actividad androgénica en modelos preclínicos. Por ejemplo, RAD140 se dosificó en ratas macho jóvenes castradas e intactas para evaluar sus efectos a través de una gama de fondos de señalización androgénicos endógenos. La rata castrada joven proporciona un ensayo in vivo muy sensible para la actividad androgénica porque el animal es relativamente naïve a los andrógenos; por lo tanto, cualquier actividad de señalización de un andrógeno administrado exógenamente se superpone sobre un fondo esencialmente en blanco.20 En la figura 2,2, el efecto de aumentar las dosis de RAD140 administrado por vía oral (0.5% de metilcelulosa) en el músculo elevador de ani bulbocavernoso («levator ani «o» LABC») el peso y el peso de la próstata se muestran en relación con el vehículo (control castrado), la farsa (control no castrado) y el propionato de testosterona (TP) dosificado subcutáneamente a 1 mg/kg en aceite de maíz.21 Como se puede ver, RAD140 estimula el músculo elevador del ani a partir de una dosis de 0,03 mg / kg (po) y alcanza un nivel de eficacia equivalente al del animal operado de forma simulada a 0,3 mg/kg.
Actividad agonista selectiva de RAD140 en ratas inmaduras castradas. El músculo (ani elevador) y el peso de la próstata de los animales tratados durante 11 días se representan con controles simulados y del vehículo junto con el SD. TP es propionato de testosterona dosificado por vía subcutánea diariamente en aceite de maíz. Se incluyeron cinco ratas en cada grupo de tratamiento. * p < 0,05 vs vehículo para la próstata. §p < 0,05 vs vehículo para LABC.
Debido a que observamos consistentemente que RAD140 no logró un nivel de estimulación de la próstata o de las vesículas seminales igual a TP a 1 mg / kg (sin importar cuán alta sea la dosis de RAD140), decidimos probar si RAD140 podría antagonizar el efecto de TP en la próstata y las vesículas seminales de rata y, al mismo tiempo, determinar qué efecto podría tener la administración conjunta de RAD140 y TP en el músculo elevador del ani. A partir de los resultados mostrados en la figura 3,3, es evidente que una dosis alta de RAD140 (10 mg/kg, po) en realidad antagoniza el efecto de TP a 1 mg/kg en las vesículas seminales, pero se suma al efecto de TP en el músculo elevador del ani. Pudimos determinar que la dosis efectiva para lograr antagonismo por RAD140 es de 0,3-1 mg/kg (po) para 1 mg / kg TP (sc) (datos no mostrados). En la próstata, RAD140 también causó una tendencia descendente en la estimulación por TP, pero el cambio no alcanzó significación estadística. Por lo tanto, en el modelo de rata macho castrada joven, RAD140 parece ser un agonista andrógeno potente y completo en el ani elevador, pero un antagonista parcial más débil en la vesícula seminal y posiblemente en la próstata.22
Actividad antagonista selectiva de tejidos de RAD140. El músculo (ani elevador), las vesículas seminales y el peso de la próstata de ratas inmaduras castradas tratadas durante 11 días se representan como un porcentaje de propionato de testosterona (TP) junto con la SD. * p < 0,05 vs TP para todos los tejidos.
El objetivo de la mayoría de los modelos preclínicos in vivo es predecir mejor cómo funcionará un fármaco en la población objetivo del fármaco. Al considerar la cuestión de cuán estimulante es un andrógeno en cualquier tejido en un modelo preclínico, uno debe tener en cuenta que el nivel de fondo de señalización de andrógenos puede afectar la respuesta observada en un animal. El modelo de rata castrada tiene limitaciones porque el nivel muy bajo de andrógenos endógenos en este modelo es una situación artificial, que no se refleja en la población masculina humana adulta objetivo.23 En particular, la población masculina objetivo tendrá un fondo androgénico muy por encima de un castrado, aunque los niveles de andrógenos probablemente serán más bajos que la norma para su grupo.
Para comprender mejor cómo podría responder este grupo, decidimos observar ratas macho jóvenes intactas, ya que tienen testosterona endógena pero en niveles algo reducidos. Por lo tanto, conservan la sensibilidad de la próstata a un compuesto androgénico, pero al mismo tiempo tienen una estimulación de referencia que es más similar a la población objetivo que los animales castrados. Como se muestra en la figura 4,4, RAD140 aumentó el peso del músculo elevador por encima del del control intacto a partir de la dosis más baja ensayada (0,1 mg/kg). Curiosamente, RAD140 no demostró estimulación de la próstata por encima del nivel de control animal intacto hasta la dosis más alta probada, 30 mg / kg. Con 0,3 mg/kg, RAD140 demostró una eficacia muscular similar a la de TP con 0,5 mg/kg, pero se necesitó una dosis de 30 mg/kg de RAD140 para aproximar la eficacia prostática de 0,5 mg/kg de TP.24 De este estudio se desprende que, en ratas macho jóvenes intactas, la RAD140 tiene un rango de selectividad muy amplio en relación con las ratas tratadas con TP, así como con las ratas de control ficticio.
Actividad agonista selectiva tisular de RAD140 en ratas macho jóvenes intactas. El músculo (ani elevador) y el peso de la próstata de ratas inmaduras intactas tratadas durante 11 días se representan con controles simulados y del vehículo junto con el SD. Se incluyeron ocho ratas en cada grupo de tratamiento. * p < 0,05 vs vehículo para la próstata. §p < 0,05 vs vehículo para LABC.
Finalmente, nos interesó evaluar el efecto de RAD140 en monos cinomólgos machos jóvenes para establecer niveles de dosificación eficaces en lo que consideramos una especie preclínica más relevante. Realizamos un estudio relativamente simple y no terminal que aún nos permitía evaluar parámetros anabólicos, lipídicos y otros parámetros de química clínica. Para evaluar la actividad anabólica, primero observamos el peso corporal bruto, que sabíamos que era un marcador sensible de la acción de los andrógenos anabólicos en primates no humanos jóvenes. Los resultados de la administración de RAD140 a 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg y 1 mg/kg en el peso corporal de los animales durante 28 días se muestran en la figura Figura55.
Peso corporal de primates desde el día -21, hasta 28 días de dosificación y 21 días después de la dosis con RAD140 (0,01, 0,1 y 1 mg/kg, po).25 Se incluyeron tres monos para cada grupo de tratamiento. El cambio en el valor basal del peso corporal restado del día -1 al día 29 fue estadísticamente significativo para el 0.1 mg/kg (p < 0,01) y 1.0 mg/kg (p < 0.05) sólo para grupos. El cambio en el peso corporal en el día 29 entre el grupo de 0,1 mg/kg y el grupo de 0,01 mg/kg fue estadísticamente significativo (p < 0,05), pero no para 1,0 mg/kg y el grupo de 0,01 mg/kg (p < 0,1).
Debido al pequeño tamaño del grupo (n = 3 para cada grupo de dosificación), utilizamos el cambio de peso de fondo de cada animal durante las semanas previas al experimento para establecer la línea de base como control. Dado que el peso corporal medio para cada grupo de tres monos convergió a un número casi idéntico (día -1), con un rango de peso corporal absoluto entre grupos de solo 4,26 a 4,29 kg, representamos el peso corporal absoluto en la figura Figura 5.5. En este estudio, se alcanzó un aumento de peso medio superior al 10% en solo 28 días de administración con una dosis de solo 0,1 mg/kg, con un efecto similar observado en el grupo de administración de 1,0 mg/kg.26
Absorciometría de rayos X de energía dual («DEXA») de todos los monos se tomaron dos días antes del inicio de la dosis y un día después de la dosis final (día -2 y día 29) para determinar los efectos de RAD140 sobre el tejido magro y la grasa; los resultados se muestran en la Figura 6.6. Como se puede ver, no hubo un efecto consistente en la masa grasa absoluta, mientras que el músculo mostró una tendencia cualitativa que aumenta con la dosis. Aunque parece que la mayor parte del aumento de masa mostrado en la figura Figure55 se debió al aumento de masa magra, ninguno de los aumentos de peso tisular fue estadísticamente significativo (p > 0,05), lo que podría deberse al tamaño pequeño de los grupos (n = 3) y a desviaciones estándar relativamente grandes.27
Cambio medio en el peso del tejido del primate medido mediante análisis DEXA en el día -2 y el día 29. Desviación estándar para grasa (36, 36, 40) y tejido magro (65, 205, 188) para 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg y 1,0 mg/kg, respectivamente. Ninguno de los cambios fue estadísticamente significativo (p > 0,05).
La química clínica indicó la reducción esperada de los lípidos (LDL, HDL, triglicéridos).28 A pesar de los aumentos bastante dramáticos del peso corporal en tan poco tiempo, no hubo elevación de los niveles de transaminasas de enzimas hepáticas en ningún animal a ninguna dosis >2 veces por encima de su valor basal.29,30 Dada la relación bien establecida entre el uso de andrógenos orales y los indicadores de estrés hepático, nos complació mucho que a una dosis 10 veces mayor que la dosis totalmente efectiva, viéramos elevaciones mínimas de enzimas hepáticas.31 En resumen, RAD140 tiene todas las características de un SARM. Es selectivo de potencia, ya que estimula aumentos de peso muscular a una dosis más baja que la requerida para estimular aumentos de peso de próstata. Además, también es selectivo de la eficacia, porque es completamente anabólico en el músculo, pero demuestra una eficacia menos que completa en la próstata y las vesículas seminales y, de hecho, puede antagonizar parcialmente la estimulación de las vesículas seminales inducida por la testosterona. RAD140 tiene una excelente farmacocinética y también es un potente anabólico en primates no humanos. Creemos que el perfil preclínico general de RAD140 es muy bueno, y el compuesto ha completado la toxicología preclínica tanto en ratas como en monos. Actualmente estamos preparando RAD140 para estudios clínicos de fase I en pacientes que sufren pérdida de peso grave debido a caquexia por cáncer.