Resumo
Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), é uma planta medicinal, usada tradicionalmente na Europa para o tratamento de vários problemas de saúde, especialmente como colírio para tratar do olho doenças como a conjuntivite e blefarite que pode ser associada a infecções bacterianas. Algumas espécies de Eufrásia já foram relatadas como contendo óleo essencial. No entanto, a composição e bioatividade do óleo de E. rostkoviana são desconhecidas. Portanto, no presente estudo, investigou-se a composição química e atividade antimicrobiana do eyebright óleo essencial contra alguns organismos associados com infecções oculares: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. A análise GC-MS revelou mais de 70 constituintes, com ácido N-hexadecanóico (18,47%) como principal constituinte seguido de timol (7,97%), ácido mirístico (4,71%), linalol (4,65%) e anetol (4,09%). O óleo essencial demonstrou efeito antimicrobiano contra todos os organismos testados, à excepção de P. aeruginosa. Foi observada a melhor actividade contra todas as bactérias Gram-positivas testadas com as concentrações inibitórias mínimas de 512 µg/mL. Este é o primeiro relatório sobre a composição química do óleo essencial E. rostkoviana e sua atividade antimicrobiana.
1. Introduction
Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne( Scrophulariaceae), has been used in Europe for centuries as a traditional medicine for treatment of various diseases. Decocções e infusões de floração partes aéreas são usadas contra tosse seca, rouquidão, tratamento sintomático de frio, dor de ouvido, dor de cabeça, febre do feno, purulenta lesões de pele, ou catarrhal doenças do trato intestinal, mas especialmente como colírio para tratar e prevenir distúrbios oculares, como conjuntivite, blefarite, fadiga ocular, inflamação ocular purulenta, e chiqueiros . O uso de chá eyebright também tem sido relatado em medicamentos etnoveterinários para o tratamento da infecção do olho da vaca . Apesar de séculos de uso tradicional para o tratamento de doenças do olho, houve apenas um coorte prospectivo, experimental realizado, confirmando a eficácia de Euphrasia colírio no tratamento de conjuntivite e um único estudo clínico investigar o efeito do local de aplicação de colírios com antibióticos, o consumo em recém-nascidos . Além disso, até aos recentes relatórios sobre a actividade anticandidal e antibacteriana de alguns extractos de Eufrásia, o espectro de acção antimicrobiana tem sido completamente desconhecido.o efeito terapêutico de E. rostkoviana pode ser atribuída principalmente à sua atividade antioxidante, anti-inflamatória e antimicrobiana . Entre os compostos anteriormente identificados nos extractos de E. rostkoviana , apigenina, luteolin, kaempferol, quercetina, ácido cafeico, ácido cumárico e ácido rosmarínico, pode ser responsável pela acção antimicrobiana. Embora tenha sido previamente notificada a presença de óleo essencial (EO) em E. officinalis L. e E. stricta Kunt, a composição e bioactividade da E. rostkoviana EO são desconhecidas. Portanto, no presente estudo, investigou-se a composição química e atividade antimicrobiana do eyebright EO contra o painel de três bactérias Gram-positivas (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis) e três bactérias Gram-negativas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa), e um leveduras (Candida albicans), organismos comumente associada com infecções oculares.2. Material e métodos
2.1. Produtos químicos e Material Vegetal
O autêntico normas borneol, a cânfora, o carvacrol, carvona, caryophyllene, p-cymene, estragole, eucaliptol, limoneno, linalol, mentol, menthone, β-myrcene, γ-terpinene, e timol para EO identificação dos componentes, bem como o controle de antibióticos ciprofloxacina e tioconazole foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Praga, República checa). Hexano (Merck, Prague, Czech Republic), dimetilsulfoxide (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Czech Republic), and Tween 80 (Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) were used as solvents. O material vegetal utilizado para a destilação do óxido de etileno foi adquirido a partir de fontes comerciais (F-DENTAL, Hodonín, República Checa). O óxido de etileno foi extraído por hidrodestilação utilizando aparelhos do tipo Clevenger.
2, 2. Análise química da MP por Cromatografia gasosa-Espectrometria de Massa (GC-MS)
O E. rostkoviana EO foi analisado por GC-MS usando Agilent 7890A GC acoplado a Agilent 5975C único-quadripolares de massa do detector equipado com um HP-5MS coluna (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm de filme) da Agilent (Santa Clara, CA, EUA). Hexano foi utilizado como solvente e o volume de amostra de 1 µL foi injetado no modo split (relação 20 : 1) para o injetor aquecido a 250°C. A partida de temperatura do forno foi fixado em 60°C por 3 min, programado para 230°C a uma taxa de 3°C/min e, em seguida, mantida constante por 10 min. O hélio foi usado como gás portador com o débito de 1 mL / min. A análise em foi realizada em Modo de varredura completa e a energia de ionização de elétrons foi definida em 70 eV. A identificação de componentes individuais foi baseada na comparação de seus espectros de massa e índices de retenção relativa com o Instituto Nacional de padrões e biblioteca de tecnologia (NIST, EUA) e literatura , bem como na coinjeção de padrão autêntico.
2, 3. Estirpes bacterianas e meios de cultivo
as estirpes padrão de três bactérias Gram-positivas Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 E S. epidermidis ATCC 12228, três bactérias Gram-negativas Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, e uma levedura Candida albicans ATCC 10231 foram obtidos a partir de Oxoid (Basingstoke, Reino Unido). O caldo Mueller-Hinton ajustado à catião (MHB) e o caldo de dextrose Sabouraud (SDB) foram utilizados como meio de cultivo para o teste de microdilução antibacteriana e antifúngica, respectivamente, e foram equilibrados com solução salina com tampão Tris (Sigma-Aldrich, Praga, República Checa). A ágar de Mueller-Hinton (MHA) e a ágar de Sabouraud dextrose (SDA) foram utilizadas para a determinação subsequente das concentrações bactericidas e fungicidas, respectivamente. Todos os meios de comunicação foram comprados a Oxoid (Basingstoke, Reino Unido).
2, 4. Mínima Concentração Inibitória (MIC) Determinação
Os Microfones foram determinados usando o in vitro, método de microdiluição em caldo de carne seguindo as diretrizes do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) modificado de acordo com as recomendações propostas para uma avaliação eficaz da anti-infecciosa potencial de produtos naturais, usando de 96 poços placas de microtitulação. Brevemente, o óxido de etileno foi dissolvido em DMSO com adição de Tween 80 e duas vezes diluições em série foram preparadas em MHB para bactérias e em SDB para a levedura, enquanto as concentrações testadas variaram entre 4 e 2048 µg/mL. O inóculo foi preparado a partir de culturas nocturnas, de modo que as concentrações iniciais de UFC nos microplates foram de 5 × 105 e 2 × 103 UFC/mL para bactérias e leveduras, respectivamente. As placas inoculadas foram examinadas após 24 h de incubação a 35°C e mais uma vez após 48 h no caso de C. albicans. O crescimento microbiano foi medido espectrofotometricamente por Fotômetro em microplaca Multiscan Ascent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) a 405 nm. Os MICs foram expressos como as concentrações mais baixas capazes de inibir ≥ 80% do crescimento bacteriano em comparação com o controlo positivo do crescimento. Os experimentos foram realizados em triplicado em três testes independentes e os valores medianos foram usados para o cálculo de MICs. Devido à possibilidade recentemente comunicada de influência dos componentes voláteis do óxido de etileno no crescimento microbiano em poços adjacentes , foram inseridas linhas de controlo positivo do crescimento entre as linhas de diluição do óxido de etileno para detectar uma eventual influência no crescimento. Os solventes utilizados não inibiram o crescimento bacteriano em concentrações testadas. A ciprofloxacina e o tioconazol foram utilizados como antibióticos de referência para bactérias e leveduras, respectivamente.
2, 5. As alíquotas de 20 µL foram transferidas de cada alvéolo sem crescimento microbiano para as placas de MHA (placas SDA para C. albicans) após 24 h E 48 h de incubação de bactérias e leveduras testadas, respectivamente. As placas foram então incubadas durante 24 h a 35 ° C. o MBC e o MFC foram avaliados como uma diminuição ≥99,9% na UFC em comparação com o inóculo, todos realizados em triplicado em três ensaios independentes.
3. Resultados e discussão
3.1. A caracterização química dos constituintes dos óleos e das fracções bioactivas
a hidrodestilação do EO por aparelhos do tipo Clevenger rendeu 0,02% (m/v) de óleo castanho amarelado que tende a solidificar-se à temperatura ambiente, o que é provavelmente causado por uma elevada proporção de ácidos gordos (32,23% no total). GC-MS a análise da MP revelou a presença de mais de 70 integrantes, com ácido palmítico (18.47%), sendo o mais abundante componente seguido por timol (7.97%), ácido mirístico (4.71%), linalol (4.65%), anetole (4.09%), linolênico (3.81%), hexahydrofarnesyl acetona (3.16%), o ácido láurico (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.
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| R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identificação baseada na coinjecção de uma amostra autêntica; d: identificação provisória. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
o elevado teor de ácidos gordos foi anteriormente encontrado no E. stricta EO (25,7% no total) também com a maior proporção de ácido palmítico (20,3%) e ácido mirístico (3,9%) . No entanto, não há nenhum outro composto presente em quantidade significativa que indique a relação destas duas espécies de Eufrásia.
3, 2. Actividade antimicrobiana
The E. rostkoviana EO mostrou actividade contra seis dos sete organismos testados com Macs que variam entre 512 e 2048 µg/mL. As bactérias Gram-positivas eram mais sensíveis do que as Gram-negativas e a levedura, enquanto que P. aeruginosa era o único organismo que não era inibido pelo óleo nas concentrações mais elevadas testadas. Os MICs, MBCs e MFC do óxido de etileno contra todos os microrganismos testados são resumidos no quadro 2. O active concentrações são comparáveis aos relatados anteriormente, por exemplo, a EOs de Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum, ou Thymus vulgaris, especialmente no caso de anticandidal atividade . O óleo também foi mais eficaz do que os extratos de E. rostkoviana testados por Teixeira e Silva contra E. coli, E. faecalis, S. aureus e S. epidermidis. Os MICs dos antibióticos de referência contra as bactérias e leveduras susceptíveis ao E. rostkoviana EO estavam de acordo com os limites aceitáveis CLSI e relatórios anteriores, respectivamente .
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| The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Uma vez que o teor do principal ácido palmítico componente do EO não excede 20% e que existem mais de 10 outros compostos antimicrobianos que variam de 1 a 8%, é difícil sugerir os principais agentes responsáveis pelo efeito antimicrobiano do E. rostkoviana EO. O ácido palmítico foi anteriormente identificado como o principal composto de frações ativas contra bactérias Gram-negativas, mas não Gram-positivas . Por outro lado, os ácidos gordos saturados de cadeia média e os ácidos gordos insaturados de cadeia longa inibem especialmente as bactérias Gram-positivas . Além disso, o ácido láurico exerce também actividade contra vários fungos . Assim, a atividade antimicrobiana da MP é provavelmente devido a uma complexa ação antimicrobiana dos ácidos gordos com os outros bem conhecidos antimicrobiana de compostos identificados no OE, como anetole, borneol, a cânfora, o carvacrol, linalol, mentol, α-terpineol, ou timol.4. Conclusões
Em conclusão, a análise química revelou uma série de substâncias antimicrobianas presentes na E. foi confirmada a presença de rostkoviana EO e da sua actividade antifúngica e antibacteriana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Tanto quanto sabemos, este é o primeiro relatório sobre a composição e a atividade antimicrobiana de E. rostkoviana EO.
conflito de interesses
os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste artigo.Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Europeia da Ciência e pelo projecto CZ do Ministério da Educação, Juventude e Desportos da República Checa.1.07/2.3.00/30.0040; pela subvenção S do Ministério da Educação, da Juventude e dos Desportos da República Checa e pelo projecto IGA 20155012 da Universidade checa de Ciências da vida de Praga. Os autores estão gratos a Slavka Barlakova pela revisão inglesa.