Cinco Pax-6 variantes e seus padrões de expressão em lula embriões e adultos olho tecidos

realizou-se um único 3′-CORRIDA de PCR para o pigmeu lula Pax-6 (gene designado como IpPax-6) para investigar as variantes de splicing e vários loci de Pax-6 em coleoid cefalópodes. Descobrimos que não havia múltiplos loci na Lula pigméia, mas identificamos três variantes Pax-6 de comprimentos discretos. As diferenças nas sequências de aminoácidos entre estas variantes Pax-6 foram limitadas a regiões limitadas. Assim, eles foram hipotetizados para ser o resultado de eventos de splicing alternativos de um único locus. Em seguida, validamos a presença de variantes splicing usando RT-PCR e finalmente obtivemos cinco tipos de variantes splicing, incluindo um ortolog aparente de Pax-6 autêntico (Figura 1). O comprimento e a estrutura do IpPax-6 autêntico eram semelhantes aos dos genes Pax-6 encontrados em outras espécies de lulas, euprymna scolopes e Loligo pealei15, 16. O IpPax-6 autêntico (forma autêntica, 499 aa) compreende dois domínios independentes de ligação ao ADN, os domínios PD e HD e um domínio rico em C-terminal P/S/T (PST), que é o activador dedicado com uma proteína trans activadora parceira, como mostrado em muitos animais (Figura 1). Tanto a similaridade da sequência proteica quanto a árvore filogenética confirmaram que IpPax-6 era um ortolog de fly ey e vertebrate Pax-4/6 (figura suplementar 1). As quatro variantes identificadas produziram proteínas com comprimentos diferentes do IpPax-6 autêntico (Figura 1).

Para explorar a fase específica de expressão do lula Pax-6 variantes, realizou-Q-PCR para vários tecidos e em diferentes estágios embrionários usando primers projetados para direcionar o adicional exões de IpPax-6 (Figura 2 & Figura S2). Os ovos de Lula apresentam gastrulação epibólica e desenvolvimento directo sem estages larvares moluscanos17. Os olhos embrionários aparecem a partir do epiderme externo do blastodisc e são diferenciáveis após o estágio 18, com pigmentação da retina começando no estágio 20. A lente aparece como uma estrutura transparente visível para o olho sem ajuda no estágio 25. Nós realizamos pela primeira vez Q-PCR utilizando primers visando exon 2, que abrange todas as cinco variantes. A análise Q-PCR mostrou que o IpPax-6 foi expresso na fase 16 antes da formação da vesícula ocular (figura 2A). A intensidade de expressão do IpPax-6 foi gradualmente aumentada com o desenvolvimento do embrião Lula (figura 2A), com o globo ocular mostrando as intensidades de expressão mais elevadas entre os tecidos testados. Como observado nos outros animais bilaterianos, as formas autênticas e variantes de IpPax-6 foram expressas em níveis acentuadamente depressivos no tecido muscular. Em seguida, utilizámos primers que visavam variantes sem exon 4 (variantes 1 e 3, Figura 2B). Os iniciadores detectaram variantes 1 e 3 em níveis baixos nos embriões na fase 16 e no tecido ocular. Também utilizamos variantes de alvos de iniciadores, incluindo exon 6 (variantes 2 e 3, Figura 2C). A análise Q-PCR mostrou que as variantes 2 e 3 foram expressas nos olhos e lobos ópticos, bem como em embriões nos estágios 16 e 25. Como a formação de células fotorreceptoras e a lente começa em embriões na fase 25, as variantes, incluindo o exon 6, podem contribuir para o desenvolvimento ocular. Os resultados demonstram que os padrões de expressão das variantes IpPax-6 diferiam significativamente dos do IpPax-6 autêntico.

para distinguir quais variantes estão presentes em cada etapa, realizamos RT-PCR utilizando conjuntos de iniciadores através dos limites de exon. A variante 1 foi considerada expressa em todas / algumas fases embrionárias, mas não nos olhos adultos (Figura 2 suplementar). A análise RT-PCR também mostrou que a variante 4 foi fortemente expressa nos olhos adultos, particularmente na retina, mas não nas lentes (figura 2A suplementar). As variantes 2 e 3 foram expressas em todas as fases embrionárias e também em tecidos adultos (figura 2B suplementar).

para identificar a expressão específica dos tecidos das variantes IpPax-6, realizámos hibridização in situ utilizando sondas de ARN concebidas para se ligarem especificamente a cada variante (figura 2D–G). A sonda RNA projetada a partir do exon 2 atinge todas as cinco variantes identificadas neste estudo. A sonda RNA concebida a partir de exon 4 ligada à forma autêntica e às variantes 2 e 4. O IpPax-6 foi encontrado localizado na área do cérebro, incluindo o lobo basal dorsal, lobo frontal superior, lóbulos peduncles/olfativos e lóbulos ópticos (figura 2D–G), como descrito em Hartmann et al.18 o tecido fora da retina (talvez correspondente à futura camada iridóforo) também expressou claramente IpPax-6 na fase 22 (figuras 2D e 2D’). A expressão IpPax-6 foi observada nesta camada até ao estádio 25. A hibridação in situ utilizando a sonda que visava o exon 4 sugeriu que as variantes 2 e 4 tinham padrões de expressão semelhantes no cérebro, mas não nos olhos (figura 2E). Esta descoberta sugere que as variantes 1 e 3 (faltando exon 4) são upreguladas na camada exterior dos olhos. Estas consequências implicam que cada variante IpPax-6 é regulada independentemente nos processos de formação ocular.

exon-intron structure of Pax-6 in other cephalopods/molluscs

investigámos se este tipo de splicing alternativo só foi adquirido em cefalópodes coleóides. Aplicando a análise RT-PCR à Lula-lança japonesa (Loligo bleekeri) RNAs embrionárias, encontramos três tipos de mRNAs possivelmente derivados de splicing alternativo (exon 4 skipping, inserção exon 3 e inserção exon 6) nos olhos (figura 3A, B). Os exons 3 e 6 inseridos codificaram 20 e 40 aminoácidos, respectivamente, enquanto o exon 4 ignorado codificou 51 aminoácidos. Para examinar a presença de splicing alternativo semelhante em outros genomas moluscanos, examinamos as estruturas exon-intron de Pax-6 na Coruja limpeta e ostra-pérola. O genoma completo sequência da coruja limpet (Lottia gigantea, obtido a partir de JGI genoma portal Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 e a pérola da ostra (Pinctada fucata, obtidos a partir de OIST Marine Genomics Unidade genoma navegador P. fucata_ver1.0, transcrição: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, scaffold8418.1) 20 mostraram que o molluscan Pax-6 tem cinco exons. A Exon 4 da Lula foi conservada através das espécies moluscanas testadas. No entanto, os exons 3 e 5 não foram encontrados no gene da ostra-pérola Pax-6. Assim, descobrimos que as formas 2 e 4 variantes foram adquiridas na linhagem cefalópode coleóide (Figura 1).

o melhor de nosso conhecimento, o nosso estudo é o primeiro relatório no quadro de variantes de splicing de lula Pax-6 que foram expressas de forma diferente de acordo com a fase embrionária. Estudos anteriores isolaram tipos discretos de variantes de splicing que haviam perdido a metade N-terminal do domínio PD em outras especies de Lula 15,18, mas estas variantes não mostraram diferenças espácio-temporais na expressão. Nosso estudo também sugeriu que os mecanismos subjacentes à aquisição de variações na Pax-6 transcrições por splicing alternativo foram exclusivamente adquiridas no coleoid cefalópode linhagem, como o menor moluscos, como os bivalves, não possuem um correspondente exão-como fragmento em seus genomas.

função das variantes de lulas Pax-6 e seu papel putativo no desenvolvimento ocular

a adição e Eliminação de um fragmento de aminoácido codificado nos exões usados alternativamente é esperado para causar mudanças estruturais nas variantes proteicas IpPax-6, que podem alterar a sua função no processo de desenvolvimento. Duas de suas variantes (variantes 1 e 3) não possuem um 153mer no meio do autêntico Pax-6 e metade do HD (Figura 1). Para explorar se a exclusão influencia suas propriedades funcionais, realizamos previsões estruturais tridimensionais (3D) das proteínas baseadas em modelagem comparativa. As estruturas putativas 3D do HDs do IpPax-6 autêntico e a variante que faltava o segmento codificado por exon 3 foram construídas. A estrutura do modelo foi identificada pela forma ligada ao ADN para que pudéssemos prever a estrutura do IpPax-6 e a variante na forma ligada ao ADN. A estrutura putativa 3D da forma autêntica era razoavelmente bem modelada; o núcleo de resíduos, nomeadamente, Phe no loop antes da primeira hélice do HD, Leu na primeira hélice, Leu na segunda hélice e Trp e Phe na terceira hélice da estrutura do modelo, foram conservados e as três hélices do HD foram aparentemente bem embalado em um outro (Figura 3C). Os resíduos importantes para a ligação do ADN, nomeadamente, dois resíduos de Arg no braço N-terminal e resíduos polares na superfície da terceira hélice, estavam localizados razoavelmente perto da interface do ADN (figura 3C, D). No entanto, a putativa estrutura 3D da variante apresentou uma série de problemas problemáticos. Na estrutura modelada, a perda da região codificada por exon 3, que codifica a parte N-terminal da primeira hélice, foi compensada por 15 resíduos codificados em exon 2. Assim, as sequências de aminoácidos das formas autêntica e variante diferiam apenas na região contendo os 15 resíduos do lado N-terminal. Esta diferença, no entanto, aumentou significativamente a energia estrutural da variante e aparentemente desestabilizou a estrutura geral. Esta instabilidade pode resultar de uma falta de Phe no loop antes da primeira hélice e da Leu na primeira hélice. Estes componentes são evidentemente importantes para empacotar as três hélices. Além disso, dois resíduos de Arg no laço N-terminal que se ligam às bases de DNA no sulco menor na forma autêntica estavam faltando na variante. Estes problemas na estabilidade e ligação do DNA na variante sugerem fortemente que o HD da variante é instável e que o domínio tem pouca afinidade de ligação para o DNA (figuras 3D e 3D’). A falta de um HD estável sugere ainda que as variantes 1 e 3 têm diferentes locais alvo do DNA do IpPax-6 autêntico em espécies de lulas.

duas variantes (variantes 2 e 3) também exibiram uma inserção de 120 mer dentro do domínio PST (Figura 1). A sequência inserida foi considerada específica da lula (Figura 2). Esta inserção pode alterar as atividades de trans-ativação do domínio PST. A variante 4 mostrou uma inserção única (57 mer) entre a PD e HD. O programa Motif (http://www.genome.jp/tools/motif/) não encontrou domínios ou assinaturas conhecidos na sequência inserida. Esta inserção alonga um linker entre os domínios PD e HD.