bacteriófagos, também chamados fagos, são vírus que infectam especificamente bactérias e podemos confirmar a sua presença e quantificá-los utilizando uma ferramenta chamada ensaio em placas. Os bacteriofagos infectam os seus hospedeiros susceptíveis, ligando-se primeiro à parede celular bacteriana e injectando o seu material genético. Em seguida, eles sequestram a maquinaria biossintética da célula para replicar seu DNA e produzir numerosas partículas de fagage progênie, que eles então liberam por lisagem e matar a célula hospedeira.

Esta actividade lítica é a base de uma técnica de contagem de fagias amplamente utilizada conhecida como ensaio em placas ou ensaio em camada de ágar dupla. Aqui, uma mistura bacteriofágica é preparada primeiro num caldo de nutrientes derretido contendo ágar-ágar de baixa concentração. Todas as bactérias utilizadas na mistura devem estar vivas e dividir ativamente na fase logarítmica do seu crescimento, o que assegurará que uma grande percentagem das bactérias sejam viáveis e capazes de formar um relvado denso em torno das placas. Em seguida, esta mistura de ágar bacteriano-fagoso fundido é espalhada por um meio nutriente de ágar mais sólido e concentrado, que já é solidificado em uma placa de Petri. Na incubação à temperatura ambiente, o caldo de agar-fagina de baixa concentração também solidifica para formar uma cobertura de agar macia.aqui, as células bacterianas podem obter nutrientes adicionais da camada inferior e devem multiplicar-se rapidamente para produzir um relvado confluente de bactérias. No entanto, como as partículas fagadas também estão presentes na camada macia, estas irão infectar e replicar o seu material genético dentro da bactéria, culminando em lise celular, que liberta múltiplos descendentes. Estes descendentes de fagias, em seguida, infectam as células vizinhas, como o estado semi-sólido da camada de fagina bactéria restringe seu movimento para células hospedeiras mais distantes. Este ciclo de infecção e Lise continua ao longo de várias rondas, matando um grande número de bactérias em uma área localizada. O efeito das células vizinhas sendo destruídas, é produzir uma única zona circular clara, chamada de placa, que pode ser vista a olho nu, efetivamente amplificando a atividade bacteriana lítica da praga e permitindo a sua enumeração.

O número de placas em uma placa de Petri são referidos como formadora de Placa de Unidades, ou PFUs, e, proporcionando inicial de um bacteriófago concentração foi suficientemente diluídas, devem corresponder directamente para o número de infeccioso fago partículas na amostra original. Esta técnica também pode ser usada para caracterizar a morfologia da placa, para ajudar na identificação de tipos de fagias, ou para isolar mutantes de FAG. Neste laboratório, você aprenderá como realizar o teste da placa para enumerar as phagens, usando a phage T7 de E. coli como um exemplo.em primeiro lugar, identifique um meio adequado para a cultura das células bacterianas hospedeiras e do bacteriófago. Aqui o caldo lisogénico, ou meio LB, foi usado para a cultura de E. coli e a fagina T7. Em seguida, pegue três garrafas de vidro limpo e rotulá-los com mídia, nome, e, em seguida, o primeiro como lb-caldo, o segundo como lb-fundo ágar, e o terceiro como lb-Top ágar. Agora, pesar quatro gramas de pó LB pré-formulado em três conjuntos e depois transferir um conjunto de meio seco pesado para cada frasco. Adicione 200 mililitros de água à primeira garrafa. Misturar o conteúdo com uma barra de agitação magnética.em seguida, utilizando um medidor de pH e agitação constante, introduzir o pH final para 7.4 através da adição de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico. Repita a adição de água e ajuste de pH para as outras duas garrafas restantes, bem. Agora, pesar três gramas de pó de ágar e adicioná-lo ao segundo frasco para fazer um ágar de fundo de 1,5%. Finalmente, pesar 1. 2 gramas de ágar-ágar e adicioná-lo ao terceiro frasco para fazer o .Ágar superior a 6% LB. A condição do caldo no frasco não necessita de adição de ágar. Tapar o frasco semi-firmemente e, em seguida, esterilizar os meios de comunicação por autoclave a 121 graus Celsius durante 20 minutos. Uma vez concluído, retire os frascos do autoclave e rode imediatamente as tampas do frasco para os fechar completamente para evitar a contaminação. Mantenha os suportes LB-caldo e Lb-Top Agar no banco para uso posterior. Colocar o Ágar lb-Bottom para arrefecer num banho de água pré-regulado para aproximadamente 45 graus Celsius.quando o ágar lb-fundo atingir aproximadamente 45 graus Celsius, transferi-lo para o banco de trabalho. Em seguida, esterilizar o espaço de trabalho usando 70 % de etenol. Em seguida, adicionar 450 microlitros de cloreto de cálcio molar esterilizado ao ágar fundido para obter uma concentração final de 2.25 milímetros. Rode suavemente o frasco para misturar. Em seguida, coloque sete placas de Petri limpas. Etiquetar cada prato na parte inferior com o nome da mídia e data de preparação. Em seguida, despeje 15 mililitros do ágar inferior em cada uma das sete placas de Petri. Permitir que as placas para definir por algumas horas ou durante a noite à temperatura ambiente. Uma vez definido, as placas de cultura podem ser armazenados em quatro graus Celsius por vários dias, se necessário, de cabeça para baixo para minimizar a condensação. Transferir as placas de Petri do frigorífico de quatro graus Celsius para uma incubadora de 37 graus Celsius uma hora antes do ensaio.no dia anterior à pré-formação do ensaio, A E. coli deve ser cultivada. Aqui, 10 microlitros de cultura de E. coli foram inoculados em 10 mililitros de caldo de LB. Colocar a bactéria a crescer durante a noite numa incubadora agitada a 37 graus Celsius a 160 RPM. Em seguida, no dia do ensaio, remover a cultura bacteriana da incubadora. Semente de 10 mililitros frescos de caldo LB fresco com 0,5 mililitros da cultura da noite. Coloque estas células para crescer numa incubadora agitada, fixada em 37 graus Celsius a 160 RPM. Em seguida, use um espectrofotômetro para verificar quando esta cultura atinge o crescimento da fase logarítmica, indicado por uma densidade óptica de 0,5 a 0,7. Uma vez que a OD atinge este nível, pare a incubação transferindo a cultura de células para o banco. Eles estão agora prontos para ser usados para o teste de cobertura de Fages.os títulos de Fagina podem variar exponencialmente em diferentes tipos de fagina e amostras. Por isso, para os contar eficazmente, devem ser diluídos para gerar uma vasta gama de concentrações de fagias. No dia do ensaio, gerar uma série de diluições de fagias que variam entre um décimo e um milionésimo de concentrações, seguindo uma técnica de diluição de 10 vezes. Para obter dados estatisticamente significativos e precisos, efectuar a diluição em série em triplicado.a seguir, derreter o ágar solidificado de topo de LB usando um microondas. Em seguida, coloque-o em um banho de água que é pré-ajustado a 45 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, recolher as placas de Petri que contêm a camada de ágar inferior da incubadora. Etiquetar as placas com a concentração de phage e a data do ensaio. Em seguida, coloque sete tubos de ensaio limpos. Rotular cada tubo de ensaio com o número de diluição da FAG em série e designar um como controlo.quando o ágar de topo LB atingir 45 graus Celsius, transfere-o para o banco de trabalho. Agora, adicione 450 microlitros de um cloreto de cálcio molar ao ágar de 200 mililitros para fazer uma concentração final de 2,25 milímetros. Rode suavemente o frasco para misturar. Em seguida, adicionar 35 mililitros de ágar LB-top e quatro mililitros de suspensão bacteriana a um tubo cónico estéril. Rode suavemente para distribuir uniformemente as células, mas evite agitar para evitar a formação de espuma.cinco mililitros desta mistura de ágar de topo bacteriano para cada um dos sete tubos de ensaio. Em seguida, transferir 100 microlitros das amostras bacteriofágicas e dos meios de controlo diluídos em série, que devem ser simplesmente meios sem bacteriofagia, para os tubos de ensaio respeitosamente rotulados. Rode a mistura suavemente para assegurar a mistura adequada. Transferir suavemente cinco mililitros de mistura bacteriofágica para a respectiva placa de Petri. Espalhar uniformemente a mistura por toda a superfície rodando suavemente a placa de Petri.uma vez que todas as placas de Petri estão em camadas com a mistura, permitir a solidificação da camada superior, incubando à temperatura ambiente durante 15 minutos. Após a conclusão destes passos, repita o processo para o segundo e, em seguida, o terceiro conjunto das placas de Petri usando os dois conjuntos restantes de diluições de FAG. Selar cada prato com parafilme e incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos. Colocar a placa de cultura de cabeça para baixo a uma temperatura adequada durante 24 horas ou até que se desenvolvam placas. Aqui, as placas foram colocadas em uma incubadora de 37 graus Celsius por um dia, uma condição de crescimento estimulante para E. coli e phage T7.placas aparecem após um a cinco dias de incubação, dependendo da espécie bacteriana, condições de incubação e a escolha do meio. Aqui, placas eram visíveis após um dia de incubação a 37 graus Celsius. Comece por verificar as placas marcadas controle e certifique-se de que não placas foram formados nestas placas, uma vez que isso indicaria contaminação viral. Para determinar o título de FAG na amostra original, começar pelas placas que contêm a amostra de fagina mais diluída em primeiro lugar e contar as placas sem remover as tampas, marcando-as para indicar quais já foram contadas. Repetir a contagem para cada prato em cada conjunto. Algumas placas podem ter muito ou muito poucas placas para serem contadas. Considere 10 a 150 como uma contagem ideal de placas.em seguida, gerar uma tabela listando os valores do número da placa para as diferentes diluições e réplicas. Em seguida, calcular os valores médios do número de placas de diluição que continham o número ideal de contagens de placas. Neste exemplo, estes foram o número médio de placas formadas nos 10 a menos três e 10 a menos quatro placas de diluição. Agora, ajustar o factor de diluição da FAG por divisão dos valores médios obtidos em placas pelos respectivos factores de diluição da FAG. Aqui, o número médio de placas formadas aos 10 aos menos três e 10 aos menos quatro placas de diluição, foram divididos por seus respectivos fatores de diluição para obter o número de unidades formadoras de placas, ou PFUs, em 100 microlitros de mistura de FAG. Para converter o valor para PFU por mililitro, multiplicar os valores gerados por 10, como se apenas a 100 microlitros do fago, diluição, mistura foi utilizada durante o bacteriófago sobreposição etapa de preparação, produzindo um fator de diluição adicional de 10. Por último, calcular a média dos valores obtidos a partir das diferentes placas de diluição. Isto dará o número médio de PFUs por mililitro. O número de PFUs corresponde ao número de partículas fagadas infecciosas na amostra original.