como com o isolamento do DNA, os cientistas geralmente dependem de kits de isolamento de RNA para tornar sua vida mais fácil. Recentemente, publicamos um blog sobre purificação de DNA sem um kit que delineou várias razões para fazer algo sem um kit tem vantagens: menos resíduos de plástico, a um custo menor, e menos de ficar com um monte de soluções aleatórias quando todos os spin colunas correr para fora. Neste artigo, nós cobrimos o básico de isolar o RNA sem um kit.dicas para trabalhar com ARN (quer esteja a utilizar ou não um kit)

embora escusado seja dizer que se deve ter cuidado sempre que se faz qualquer tipo de purificação de ADN ou ARN para evitar a contaminação, tome mais cuidado ao efectuar a extracção de ARN. O RNA não é inerentemente tão estável como o ADN – é de cadeia simples e os seus grupos ribose são susceptíveis a hidrólise e degradação do calor. Além disso, RNases, ou enzimas que degradam o RNA, são proteínas especialmente resistentes que são encontrados em e em tudo, incluindo a sua pele. Aqui estão algumas dicas gerais para trabalhar com RNA, mesmo que você esteja usando um kit:

• Use sempre luvas, como as RNases em suas mãos podem degradar RNA.manter uma área de trabalho limpa, que pode incluir pulverizar o seu banco com um produto para se livrar de RNases, como o RNaseZAP.ao colher tecidos, células, plantas, fungos ou bactérias, manter as amostras frias e trabalhar rapidamente para mitigar a degradação do ARN.certifique-se de utilizar água livre tratada com RCP ou RNAse. Se utilizar água tratada com DEPC, autoclave a água para inactivar o DEPC. assegure-se de que os artigos de plasticware ou de vidro utilizados são livres de RNase. O material plastificado isento de RNase está prontamente disponível junto de fornecedores científicos e o material de vidro deve ser tratado com uma solução DEPC durante 1 hora e autoclavado para remover o resíduo DEPC. Em alternativa, os objectos de vidro podem ser cozidos a 180°C durante pelo menos 4 horas. se a(s) Sua (s) amostra (S) final (s) de RNA forem ressuspendidas em água ou tampão TE, armazená-las no congelador a-80°C para evitar a degradação do RNA. Degradam-se no congelador a -20 ° C.

os métodos de extracção de ARN evoluíram para um protocolo simples ainda usado hoje

Existem muitos métodos alternativos para isolar o ADN sem um kit. No entanto, esse não é o caso para a extração e purificação de RNA. Há um método simples que funciona, e variações a esse método. Um dos principais obstáculos ao desenvolvimento de protocolos para isolar o RNA foi que as RNases são comumente encontradas em células, e sem algo para bloquear a atividade da RNase sobre a lise celular, o RNA é degradado. Para isolar efetivamente o RNA intacto, seria necessário um rápido e forte desnaturante proteico-algo que quebrou as RNases antes que as RNases tivessem a chance de quebrar o RNA após a lise celular.

no final dos anos 1970, Chirgwin e colegas mostraram que um forte desnaturante proteico, tiocianato de guanidínio, fez exatamente isso (Chirgwin et al., 1979). Eles desenvolveram um protocolo destinado a isolar o RNA dos baços de rato, no qual homogeneizavam os baços numa solução de tiocianato de guanidínio e reduziram o homogeneizado para remover o material insolúvel. Em seguida, o homogeneizado foi carregado em gradientes de césio-cloreto e ultracentrifugado por até 20 horas para separar o RNA intacto do DNA e proteínas. Embora muito eficaz no isolamento do RNA total, este método requer muito tempo e dependendo de quantas amostras você pode ter, acesso a um ou mais grandes, ultracentrifuge caro.

Figura 1: um esboço dos diferentes passos na extração de RNA.

pesquisadores no NIH em meados de 1980 foi estabelecido para desenvolver um protocolo que ignorou a ultracentrifugação completamente. Chomczynski e Sacchi mostraram que o RNA poderia ser efetivamente separado do DNA e proteínas por um simples protocolo de extração com tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio. Neste método, as amostras ainda são homogeneizadas e lisadas numa solução de tiocianato de guanidínio. No entanto, em vez de separação de RNA usando gradientes de césio-cloreto, fenol saturado de água, acetato de sódio e clorofórmio são adicionados ao homogenado e agitados. Após uma centrifugação rápida (não ultracentrifugação!), as camadas de fenol e clorofórmio separadas, e RNA é retido no topo, camada aquosa, enquanto DNA e outras proteínas são retidas na interfase e no fundo, camada orgânica. A camada aquosa superior é extraída e o RNA pode então ser precipitado com isopropanol. Este método reduziu o tempo necessário para isolar o ARN de 20 + horas para cerca de 4 horas, e as variações deste método no-kit ainda são amplamente utilizadas hoje (Chomcynski e Sacchi, 2006).

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tornando o protocolo simples ainda mais infalível (ainda sem um kit!)

como mencionado acima, trabalhar com RNA requer manter as amostras Frias até homogeneização e lise celular. Isso pode ser um desafio dependendo da sua situação laboratorial ou método de coleta de tecidos, então as empresas de biotecnologia têm comercializado vários produtos que ajudam a simplificar ainda mais este processo e/ou estabilizar o RNA durante a coleta de tecidos e homogeneização. O mais conhecido destes produtos é TRIzol® (também chamado Tri Reagent®, RNAzol®, QIAzol® e vendido por muitas empresas diferentes). TRIzol® é uma solução acid-guanidinium-fenol que combina a solução de homogeneização com a adição fenol do protocolo no-kit original numa única etapa. Após homogeneização em TRIzol®, o material insolúvel é removido por centrifugação e o sobrenadante é extraído com clorofórmio, como no método no-kit acima. os pesquisadores também desenvolveram formas de “estabilizar” o RNA dentro dos tecidos antes da lise celular. Estes produtos, nomeadamente RNAlater® do termo e RNAProtect® do Qiagen, são soluções à base de sulfato de amónio que funcionam inibindo a actividade da RNase dentro das células ou tecidos-na verdade não estabilizam quimicamente as moléculas de ARN (Allwell e Sarma, 1974). Além disso, o ThermoFisher fornece um protocolo sobre como integrar RNAlater® com o uso de TRIzol® e soluções de estabilização de sulfato de amônio podem ser feitas em casa.

um problema comum com métodos de extração de RNA sem kit é a transição de DNA que pode potencialmente complicar os resultados de uma aplicação a jusante, como a PCR quantitativa para avaliar a expressão do gene. Há várias coisas que os investigadores podem fazer para combater esta questão. Em primeiro lugar e acima de tudo, esteja atento às suas extracções – se você precisa de RNA realmente limpo, é importante ter certeza de que ao extrair, para apenas pegar a camada aquosa para evitar transporte de DNA a partir do fundo, a camada orgânica. Outro truque é precipitar o RNA usando cloreto de lítio. As soluções LiCl precipitam selectivamente o ARN, mas não o ADN e as proteínas. Por último, a utilização de uma DNase (existem vários produtos enzimáticos DNase no mercado para escolher) na sua amostra de RNA ressuspenso ajudará a garantir que a contaminação do ADN não é um problema.

Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ (1979) Isolamento de biologicamente ativo, o ácido ribonucleico a partir de fontes enriquecido em ribonuclease. Biochemistry 18: 5294-5299. https://doi.org/10.1021/bi00591a005

Chomczynski P, Sacchi N (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1:581–585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83