HPV/p16 positivos e negativos HNSCC mostrar as diferenças no envolvimento nodal
determinou-se o HPV e p16 estado de 241 orofaríngea carcinoma de células escamosas (OPC) pacientes tratados com (quimioterapia)radiação (c)RT. As amostras de tumores humanos foram adquiridas de acordo com protocolos aprovados pelo Conselho ético dos Hospitais Universitários Leuven (Leuven, Bélgica) e foi obtido o consentimento implícito de todos os pacientes. Os dados clinicopatológicos foram extraídos das tabelas de pacientes e o tempo médio de seguimento foi de 4,19 anos. Os doentes positivos para o HPV foram caracterizados por estadios t inferiores com 45% (26 em 58; p = 0, 025) dos doentes positivos para o HPV mostrando tumores em estadios T1/2, enquanto que este foi 29% (51 em 175; p = 0, 025) no grupo negativo para o HPV. Além disso, os tumores positivos ao HPV mostraram ser significativamente mais elevados (p = 0.014) envolvimento nodal com 72% (42 em 58) dos doentes positivos para o HPV que apresentaram tumores N2/N3, enquanto este foi apenas 54% (95 em 175) no grupo negativo para o HPV. Embora a relação entre o estado p16 e o Estado N não fosse significativa, observou-se uma tendência para maior envolvimento nodal e positividade p16. Sessenta e três% dos pacientes P16 positivos apresentaram tumores N2/N3, enquanto que este foi apenas 54% no grupo P16 negativo (Tabela 1). Estes resultados estão em concordância com outros estudos, mostrando que os doentes com HNSCC positivos para o HPV têm estadios N E T mais baixos .
Como previsto, baixa T estágios, resultou em melhor distante de controle (DC) taxas de 5 anos de índices de controle de 83% e 70% (p = 0,04) por T1/T2 e T3/4 tumores, respectivamente (arquivo Adicionais 1: Figura S1A). Os tumores N2/3 (5 anos DC 70%; p = 0, 02) mostraram um maior risco de falha distante em comparação com tumores N0/1 (5 anos DC taxa 85%; p = 0, 02) (ficheiro adicional 1: Figura S1B). Não se observou diferença estatisticamente significativa na taxa DC entre a doença positiva e a doença negativa por HPV (taxa DC de 82% vs taxa DC de 72% a 5 anos, respectivamente; p = 0, 20) (ficheiro adicional 1: Figura S1C). Embora não significativa, esta diferença de 10% nas taxas DC sugere influência do vírus além do controle local do tumor. Além disso, indica a presença de diferentes padrões de disseminação entre o HNSCC positivo e negativo do HPV.
p16 reprime a invasão e a capacidade de migração do HPV positivo HNSCC
para investigar o mecanismo molecular por trás destas potenciais diferenças observadas na metástase no nosso coorte de doentes, avaliámos a migração in vitro e a capacidade de invasão das células HNSCC. As células SCC154 e SCC104 positivas para o HPV/p16 mostraram uma taxa de migração significativamente mais baixa em comparação com as células SQD9 negativas para o HPV/p16, CAL27 e SC263 (Fig. 1a). De acordo com o doseamento da migração, as células positivas do HPV/p16 mostraram capacidades de invasão reduzidas em comparação com as células negativas do HPV/p16 (Fig. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). d capacidade de invasão das células SCC154 positivas do HPV tratadas com shRNA para p16 (shp16) e controlo (shluc). (a-d) O resultado é apresentado como média ± SEM de três experimentos e p-valores calculados pelos dois lados do t-teste
O supressor de tumor p16 é um conhecido ciclo celular regulador, e um bom substituto marcador para HPV positivo HNSCC . Além disso, dados recentes atribuem um papel mais amplo ao p16, incluindo um papel na migração e na repressão da angiogênese . Portanto, também examinamos a influência de p16 sobre a migração e a capacidade de invasão das células SCC154 positivas do HPV manipuladas com Rna de gancho curto (shRNA) para p16 (shp16) e shRNA de controle (shluc). A regulamentação da expressão p16 aumentou as capacidades de migração e invasão das células SCC154 (Fig. 1c e d). Estes dados verificam a presença de diferenças nos padrões de disseminação entre o HNSCC positivo e negativo do HPV e sugerem um papel activo do p16 na cascata metastática.
p16 suprime a migração e invasão através de angiogênese na HPV positivo HNSCC
Ele é bem conhecido que a angiogênese, que é activamente apoiado em células de câncer pelo pro-fatores angiogênicos, tais como fator de crescimento endotelial vascular (de UM VEGFA), é um canal para o câncer de propagação celular e metástase, e promove agressivo a progressão tumoral . Além disso, a correlação negativa entre HPV/p16 e VEGFA é descrita anteriormente no HNSCC . Portanto, avaliamos a relação entre HPV, p16 e VEGFA em nossa coorte de pacientes. Os doentes positivos para o HPV apresentaram expressão VEGFA significativamente mais baixa, com 54% (28 em 51) dos doentes a apresentarem expressão VEGFA sem ou baixa comparativamente a 32% (53 em 161) no grupo negativo para o HPV (Tabela 2). Embora a correlação negativa entre VEGFA e p16 tenha sido menos pronunciada, observou-se uma tendência para significância (Quadro 2).
foi ainda investigada a relação entre a angiogênese e p16 com a vivo xenoenxertos injetado com SCC154 HPV positivo células manipuladas com shp16 ou shluc. Um número mais elevado de vasos sanguíneos foi detectado em ratinhos tumores com expressão baixa de p16 em comparação com tumores de controlo (Fig. 2a). Além disso, o aumento na vascularização resultou em baixa necrose, maior número de células mitóticas e vantagem de crescimento de tumores expressantes shp16 (arquivo adicional 2: Figura S2A-C). Não pudemos verificar o envolvimento de p16 na supressão de metástases in vivo devido à ausência de um modelo animal metastático. No entanto, a vantagem de crescimento e o aumento da vascularização observado nos tumores do Ratinho shp16 podem explicar a ocorrência frequente de estadios t avançados em doentes com HNSCC negativos para o HPV.
duplo papel de p16 na disseminação de HNSCC. formação de vasos sanguíneos em modelos de ratinhos xluc shluc e SCC154 avaliados por coloração CD31 (acima do gráfico); n = 5. b número médio de formação de vasos linfáticos em modelos de xenovídeos SCC154 shp16 e SCC154 shluc avaliados por coloração de LYVE – 1 (acima do gráfico); n = 5. c pontuação média dos modelos xenograft de rato alpha4 beta1 integrin em SCC154 shp16 e SCC154 shluc; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-d P-valores calculados pelos dois lados do t-teste
p16 estimula a linfangiogênese e nodal propagação do HPV positivo HNSCC
Estes resultados ainda não explicar a ocorrência de semelhante distante taxas de recaída em HPV/p16 positivos e negativos HNSCC pacientes e, certamente, não explicar o altamente associação significativa entre a positividade do HPV e envolvimento ganglionar descritas em nosso e em vários outros estudos . Isto é especialmente importante, uma vez que implica a presença de um elevado potencial metastático local no HNSCC positivo para o HPV. Interessante linfangiogênese, como a angiogênese, promove metástases tumorais induzindo o crescimento de novos vasos linfáticos dentro do tumor e aumentando o tráfico de células para os gânglios linfáticos. Além disso, o aumento da densidade dos vasos linfáticos nos tumores está associado a metástases aumentadas nos gânglios linfáticos. . Portanto, nós avaliamos a formação do vaso linfático por imunojuronano do vaso linfático homólogo (LYVE-1) imunossupressor em tumores de shluc e shp16 ratos. Descobrimos que a supressão p16 resultou em menor densidade de vasos linfáticos nos xenografts positivos HPV/p16 sugerindo um duplo papel de p16 em metástases (Fig. 2b).
para compreender a função de p16, focámo-nos nas integrinas, uma vez que estas proteínas são aceites como reguladores chave da angiogénese e linfangiogénese . Além disso, a ligação de p16 às integrinas e a perda de propagação celular está previamente documentada . As integrinas, como a alpha4 beta1, são importantes moduladores da linfangiogénese . Por conseguinte, avaliámos a presença de integrina alpha4 beta1 em SCC154 shluc e tumores de ratinhos SCC154 shp16. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).