efeitos citopatológicos (CPE): como vírus fugir com o assassinato

o Vírus, por definição, são invisíveis aos nossos olhos. São nanoestruturas que só podem tornar-se visíveis através da microscopia electrónica, uma técnica que consome tempo e não é acessível a todos. Como consequência, um virologista tem de encontrar alternativas para poder trabalhar e estudar o seu objecto de interesse. Uma maneira prática de” ver ” e indiretamente medir uma infecção viral é olhando para os danos que um vírus causa a uma célula. Este sofrimento ou dano é conhecido como efeito citofático (CPE) e sua medição é amplamente utilizada em laboratórios de Virologia em todo o mundo.

CPE é uma abordagem muito básica para entender como um vírus infecta uma célula, mas isso não significa que ele é apenas usado em pesquisa científica básica. A medição do CPEs também pode ser uma leitura muito útil para empresas farmacêuticas e laboratórios de diagnóstico. qual é o efeito citofático induzido pelo vírus?os vírus

são parasitas que precisam de uma célula hospedeira para se replicar. Uma vez dentro da célula, eles sequestram a maquinaria celular para produzir suas próprias proteínas, ácido nucleico e membrana (quando necessário). uma vez que o vírus está ocupando fatores celulares que são usados pela célula, sua replicação pode alterar as funções básicas das células hospedeiras ou mesmo destruí-lo. O conjunto de alterações celulares resultantes de uma infecção viral é conhecido como CPEs. Estas são geralmente alterações negativas que podem causar modificações estruturais, metabólicas ou funcionais na célula que está sendo infectada. Ao longo do tempo, o CPEs pode dar origem aos efeitos patológicos do vírus (a doença).

exemplos clássicos do efeito citopático

uma EPC bem conhecida induzida pelo vírus é a morte celular (Veja um vídeo de uma célula moribunda ). Muitos vírus matam células por lise ou por indução de apoptose. Por exemplo, o HIV é conhecido por matar linfócitos T CD4+, que é a principal razão pela qual indivíduos infectados se tornam imunocomprometidos.

no laboratório, uma maneira fácil de matar uma linha celular de mosquito (como C6 / 36) ou células Vero é infectando-o com qualquer famoso arbovírus, como Chikungunya, Dengue ou Zika. Após alguns dias de infecção, as células simplesmente desmoronam-se mesmo à frente dos seus olhos (Fig. 1).

Figura 1 | as células Vero foram infectadas com o vírus Zika. Após 72 h de infecção, um EPC claro é evidente pela presença de debri celular como resultado da morte celular.

outro exemplo CPE é a formação sincytia. As células infectadas por vírus com envelope expressam proteínas virais na membrana plasmática, que são usadas por vírus para mediar a fusão com a célula hospedeira. Quando estas proteínas virais se ligam aos receptores na superfície das células vizinhas, a fusão celular-celular ocorre, resultando na formação sincítica (células gigantes multinucleadas). o vírus sincicial respiratório (RSV) é a principal causa de pneumonia viral em crianças pequenas. Seu nome é derivado do fato de que pode formar síncitia em cultura celular, mas, notavelmente, também nos pulmões de pacientes infectados. as alterações da morfologia celular relacionadas com o EPC também incluem arredondamento, separação e/ou aglomeração de células aderentes. Neste caso, as células infectadas permanecem metabolicamente ativas para replicar o vírus, mas seu citoesqueleto é alterado. As alterações morfológicas podem ser explicadas por uma sub-regulação da expressão de proteínas de adesão superficial como resultado da infecção. O vírus Ebola, por exemplo, é conhecido por causar mudanças morfológicas dramáticas nas células aderentes, diminuindo a expressão da integrina β1. você realmente precisa de tanto drama (morte, gigantismo, deformação) para ser considerado um CPE? Não. As células podem apenas “comportar-se” de forma diferente quando infectadas, mas parecem iguais. Mais sutis, mas ainda claras, as alterações do tipo CPE podem incluir alteração da taxa de crescimento/cinética, alterações em uma dada atividade metabólica, ou alterações na função celular. Entre os diferentes vírus que podem induzir estes tipos de CPEs está o vírus Zika. Em 2015, este vírus transmitido por mosquitos estava em todos os noticiários porque causa microcefalia, um dano neurológico grave caracterizado por uma redução do tamanho do cérebro em fetos. Mais tarde foi descrito que a microcefalia é o resultado de vários efeitos citopáticos induzidos por Zika nas células neurais, incluindo hipertrofia celular, restrição de crescimento, disregulação do ciclo celular e morte celular. Foi utilizado um ensaio de formação de colónias, por exemplo, para identificar quais das diferentes proteínas Zika interferem com a proliferação celular. para pesquisadores que estão sistematicamente comparando a cinética de crescimento das linhas celulares, recomendamos a Omni Citosmart. Imagem cinética de células vivas de poços inteiros, usando scanning automatizado e software de costura de imagem. Imagem completa placas de poço por horas a semanas de cada vez.

os efeitos Citopáticos são o resultado de interacções vírus-hospedeiro

é importante mencionar que o EPC não é apenas definido pelo vírus, mas também pela célula hospedeira. Depende de como as células são permissivas à infecção. Sendo uma célula permissiva, que pode suportar o crescimento de um vírus. Em outras palavras, nem todos os vírus podem infectar todos os tipos de células. Para simplificar, podemos dizer que:

• Não permissivo célula – Vírus não pode infectar
• Permissivo célula – Vírus pode replicar-se, mas não causa óbvia CPE
• Altamente permissivo célula – Vírus se replica e induz um óbvio CPE

Então, se você adicionar o vírus em suas células e não acontece nada, não se preocupe. Só precisas de encontrar a combinação certa de vírus e células.

Readouts – How to measure CPE?as alterações celulares induzidas pelo vírus, como a morte celular ou uma morfologia alterada, são visíveis por microscopia de luz. Pode colocar a sua placa sob um microscópio invertido padrão e ver se as suas células morreram ou de alguma forma mudaram. Um aspecto positivo desta abordagem é que é “fácil” porque não requer qualquer processamento da amostra, o que evita a fixação ou coloração de artefatos.

no lado negativo, é qualitativo e não quantitativo, e depende fortemente da formação do observador. Hoje em dia, esta abordagem pode ser automatizada através da monitorização em tempo real da citopatogénese induzida pelo vírus. Por exemplo, as alterações virais de propagação e proliferação celular podem ser avaliadas através de um teste de cicatrização de feridas, onde pode ser detectada uma velocidade reduzida de migração coletiva e celular única, juntamente com alterações graves na morfologia celular. Outra abordagem quantitativa é a monitorização da proliferação celular através de uma análise automatizada da imagem. Com esta tecnologia é possível gerar curvas de crescimento de infectados vs. culturas celulares não infectadas para quantificar adequadamente o efeito citopático que uma infecção viral pode ter.se as células da morte são o que faz o seu dia, uma alternativa é o famoso ensaio em placas. Esta técnica de Virologia clássica é utilizada para quantificar as partículas virais infecciosas e baseia-se no princípio de que os vírus podem induzir lise celular. Depois de infectar um monolayer de células altamente permissivas, as células são contrastadas com violeta de cristal (as células vivas são coloridas, as células da morte permanecem imaculadas), resultando em belas placas (áreas de células da morte) que podem ser facilmente quantificadas a olho nu. mas não precisa de ver as suas células para saber que são a morte. A viabilidade celular após a infecção pode ser medida através da quantificação da concentração intracelular de ATP com a firefly luciferase ou com o ensaio MTT tradicional. trabalhar com vírus pode ser um aborrecimento, laboratórios BSL-3/4 têm medidas de segurança rigorosas e entrar e sair do laboratório leva muito tempo. Para pesquisadores que procuram uma solução para monitorar suas células, sem ter que entrar no laboratório, recomendamos que se olhe para o Kit Citosmart Lux2 Duo. as aplicações

o seu vírus induz um EPC? Consegues ver ou medir claramente? Muito bom! Você pode usar este CPE como leitura de uma infecção viral bem sucedida ou replicação. Um dado CPE pode servir como um indicador para descobrir como prevenir uma infecção, para caracterizar os fatores hospedeiros ou patógenos necessários para uma infecção ocorrer, para identificar tropismo do vírus, entre outros. Em termos práticos, isto significa que pode ser usado como leitura para:

• rastreio e avaliação do composto antiviral
  Pode um candidato a droga prevenir a formação de CPE?o Rastreio de anticorpos neutralizantes pode um determinado anticorpo inibir o EPC induzido pelo vírus?
• vigilância da resistência ao fármaco antiviral (fenotipagem)
  Pode um determinado isolado de vírus induzir o CPE na presença de medicamentos antivirais?Que tipos de células estão preferencialmente infectados por um vírus? Por quê? (Confira uma publicação recente com o infame SARS-CoV-2 in .)
• diagnóstico de doenças virais
  é um vírus que infecta ativamente uma pessoa? A amostra clínica é recolhida daquela pessoa que induz o EPC? Vamos ter em mente que a maioria dos métodos diagnósticos (ELISA, RT-qPCR) não detectam partículas virais infecciosas.

para concluir …

embora existam várias formas de medir a infecção pelo vírus, a verificação de CPEs em células permissivas permanece como uma alternativa amplamente utilizada. Para ser realmente útil, você precisa encontrar a combinação certa: um vírus, uma célula permissiva e uma leitura precisa. Uma vez que você encontra esta combinação, as aplicações podem ser bastante diversificadas e úteis em um ambiente acadêmico, na indústria, ou em diagnósticos clínicos.

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