Wilson creció en Detroit, Míchigan, hijo del vendedor Ralph Wilson Sr. y su esposa Edith Cole.
Decidiendo salir del estado para asistir a la Universidad de Virginia (donde se unió a la fraternidad Phi Delta Theta), Wilson regresó a Míchigan para estudiar posgrado en la Facultad de Derecho de la Universidad de Míchigan. Se graduó en 1936 de la Escuela de la Universidad de Detroit, ahora University Liggett School. Durante la Segunda Guerra Mundial, se alistó en la Marina de los Estados Unidos y sirvió en los Teatros del Atlántico y el Pacífico. Después de que terminó la guerra, se hizo cargo del negocio de seguros de su padre e invirtió en minas y fábricas del área de Michigan. Finalmente compró varios puntos de venta de fabricación, empresas de construcción, estaciones de radio y televisión, y fundó Ralph Wilson Industries.Wilson, propietario minoritario de los Detroit Lions, se enteró de los planes de Lamar Hunt para una nueva liga, la American Football League, para desafiar a la NFL. Intentó formar un equipo en Miami, pero fue rechazado. Su siguiente elección fue Buffalo, donde la primera elección de propietario de la AFL, Pat McGroder, se había negado a formar un equipo. En septiembre de 1959, Wilson envió a Hunt un telegrama con las palabras: «Cuenta conmigo con Buffalo. Llamó a su nuevo equipo los Bills, en honor a un equipo anterior que había jugado en la All-America Football Conference de 1946 a 1949. El 28 de octubre de 1959, los Buffalo Bills se convirtieron oficialmente en el séptimo equipo de la AFL. Wilson hizo del fútbol profesional un éxito rotundo en un «mercado pequeño», firmando con estrellas como Cookie Gilchrist, Jack Kemp y Tom Sestak y los miembros del Salón de la Fama Billy Shaw y O. J. Simpson.
Fue una fuerza guía en las políticas de la AFL que aseguraron el éxito, como el reparto de ingresos de gate y televisión. Como uno de los tres propietarios de la AFL en tener un terreno financiero relativamente sólido (junto con Hunt y Bud Adams), Wilson prestó a los Oakland Raiders con problemas financieros 4 400,000 y también estaba dispuesto a prestar dinero a Billy Sullivan de los New England Patriots. Wilson ayudó a mantener a flote esas franquicias, probablemente salvando a toda la liga de la retirada (la AFL fue única entre las ligas de fútbol profesional en que ni una sola franquicia de la AFL se retiró en su historia). En noviembre de 1963, Wilson junto con el entonces gerente general de los Raiders, Al Davis, presionaron con éxito para que los juegos de la AFL se pospusieran el domingo después del asesinato del presidente John F. Kennedy; los juegos de la NFL se jugaron según lo programado.
Wilson estaba más preocupado por la solvencia financiera de su equipo y fue en gran medida indiferente al éxito de los Bills en el campo; O. J. Simpson más tarde señaló de sus negociaciones contractuales con los Bills que cuando el agente de Simpson le dijo a Wilson del potencial de Simpson para hacer del equipo un contendiente al campeonato, Wilson respondió: «¿De qué me serviría un campeonato? Todo lo que significa es que todo el mundo quiere un aumento.
En 1989, después de que el comisionado de la liga Pete Rozelle anunciara su retiro, Wilson estaba en el comité de seis miembros que tenía la tarea de nominar a posibles candidatos para el puesto abierto. El candidato de Wilson, su ex mariscal de campo Jack Kemp, se negó a continuar con el puesto, ya que ya había tomado un puesto en el Gabinete de Estados Unidos. (El trabajo finalmente fue para el abogado de la liga Paul Tagliabue.)
Después de que el acuerdo original de derechos de nombre en el estadio actual de los Bills expirara en 1998, el nombre de la instalación fue cambiado de Rich Stadium a Ralph Wilson Stadium; no recibiría un nuevo acuerdo de derechos de nombre hasta 2016, después de su muerte y la posterior venta del equipo. Según un artículo sobre msn.com, Wilson, descrito como «terco», rechazó numerosos acuerdos de derechos de nombre para el estadio.
Wilson fue uno de los propietarios más abiertos de la liga, incluso cerca del final de su vida. Wilson votó en contra de la reubicación de los Cleveland Browns en Baltimore en 1995. Reprendió públicamente al comisionado de la NFL, Paul Tagliabue, en una carta abierta en 1998 sobre la política de la liga, que rechazaba las críticas a los árbitros, después de que la mala actuación tuvo un impacto directo en una pérdida de Bills esa temporada. Fue uno de los dos propietarios (Mike Brown, de los Cincinnati Bengals, siendo el otro) que se opusieron al antiguo convenio colectivo de la liga (anterior a 2011). (Wilson y Brown fueron elogiados por su previsión cuando el acuerdo más tarde llevó al cierre patronal de la NFL de 2011. También negoció un acuerdo para que su equipo jugara partidos en casa en Toronto desde 2008 hasta 2014.
Wilson se retiró de la posición de presidente en 2001, dando el control operativo al Gerente General Tom Donahoe; Wilson retomó el control de las operaciones del equipo en 2006. Wilson se retiró de nuevo como presidente del equipo, esta vez entregando todo el control de las operaciones del equipo a Russ Brandon, el 1 de enero de 2013. Continuó consultando con Brandon en operaciones de equipo y liga hasta su muerte.