expediție în America de Sud
convingerea crescuse în Humboldt că adevăratul său scop în viață era explorarea științifică, iar în 1797 a demisionat din postul său pentru a dobândi cu o mare gândire o cunoaștere aprofundată a sistemelor de măsurători geodezice, meteorologice și geomagnetice. Revoltele politice cauzate de războaiele napoleoniene au împiedicat realizarea mai multor expediții științifice la care lui Humboldt i s-a oferit posibilitatea de a participa. În cele din urmă, descurajat de dezamăgirile sale, dar refuzând să fie descurajat de scopul său, a obținut permisiunea guvernului spaniol de a vizita coloniile spaniole din America Centrală și de Sud. Aceste colonii erau apoi accesibile numai oficialilor spanioli și misiunii Romano-Catolice. Complet închise de lumea exterioară, au oferit posibilități enorme unui explorator științific. Poziția socială a lui Humboldt l-a asigurat de accesul la cercurile oficiale, iar în premierul spaniol Mariano de Urquijo a găsit un om luminat care i-a susținut cererea către rege pentru un permis regal. În vara anului 1799 a pornit din Marsilia însoțit de botanistul francez Aimus Bonpland, pe care l-a întâlnit la Paris, pe atunci cel mai viu centru științific din Europa. Moșia pe care o moștenise la moartea mamei sale i-a permis lui Humboldt să finanțeze expediția în întregime din propriul buzunar. Humboldt și Bonpland au petrecut cinci ani, din 1799 până în 1804, în America Centrală și de Sud, acoperind peste 6.000 de mile (9.650 km) pe jos, călare și în canoe. A fost o viață de mare efort fizic și privare gravă.
pornind de la Caracas, au călătorit spre sud prin pajiști și tufărișuri până au ajuns pe malurile Apure, un afluent al râului Orinoco. Și-au continuat călătoria pe râu cu canoe până la Orinoco. Urmând cursul său și cel al Casiquiare, au dovedit că râul Casiquiare a format o legătură între vastele sisteme fluviale ale Amazonului și Orinoco. Timp de trei luni, Humboldt și Bonpland s-au mutat prin păduri tropicale dense, chinuite de nori de țânțari și sufocate de căldura umedă. Proviziile lor au fost curând distruse de insecte și ploaie; lipsa hranei i-a determinat în cele din urmă să subziste cu boabe sălbatice de cacao și apă de râu. Cu toate acestea, ambii călători, încurajați de entuziasmul oferit de impresiile noi și copleșitoare, au rămas sănătoși și în cele mai bune spirite până la întoarcerea lor la civilizație, când au cedat unui atac sever de febră.după o scurtă ședere în Cuba, Humboldt și Bonpland s-au întors în America de Sud pentru o explorare extinsă a Anzilor. De la Bogot la Trujillo, Peru, au rătăcit peste Munții Andini-urmând un traseu acum traversat de autostrada Panamericană, la vremea lor o serie de cărări abrupte, stâncoase și adesea foarte înguste. Au urcat o serie de vârfuri, inclusiv toți vulcanii din împrejurimile Quito, Ecuador; ascensiunea lui Humboldt Chimborazo (20.702 picioare ) la o înălțime de 19.286 picioare (5.878 metri), dar în afara vârfului, a rămas un record mondial de alpinism timp de aproape 30 de ani. Toate aceste realizări au fost realizate fără ajutorul echipamentelor moderne de alpinism, fără frânghii, crampoane sau provizii de oxigen; prin urmare, Humboldt și Bonpland au suferit grav de boală montană. Dar Humboldt și-a transformat disconfortul în avantaj: el a devenit prima persoană care a atribuit boala de munte lipsei de oxigen în aerul rarefiat de înălțimi mari. El a studiat, de asemenea, curentul oceanic de pe coasta de vest a Americii de Sud, care a fost numit inițial după el, dar acum este cunoscut sub numele de curentul Peru. Când perechea a sosit, purtată și călcată, în Quito, Humboldt, alpinistul experimentat și colecționarul neobosit de date științifice, nu a avut dificultăți în a-și asuma rolul de curtean și om al lumii când a fost primit de vicerege și liderii Societății spaniole.în primăvara anului 1803, cei doi călători au navigat de la Guayaquil la Acapulco, Mexic, unde și-au petrecut ultimul an al expediției într-un studiu atent al acestei părți cele mai dezvoltate și extrem de civilizate a coloniilor spaniole. După o scurtă ședere în Statele Unite, unde Humboldt a fost primit de S. U. A. Pres. Thomas Jefferson, au navigat spre Franța.Humboldt și Bonpland s-au întors cu o cantitate imensă de informații. În plus față de o vastă colecție de plante noi, au existat determinări ale Longitudinilor și latitudinilor, măsurători ale componentelor câmpului geomagnetic al Pământului și observații zilnice ale temperaturilor și presiunii barometrice, precum și date statistice privind condițiile sociale și economice din Mexic. Ori de câte ori Humboldt se găsise într – un centru de comerț din America, el trimisese rapoarte și duplicate ale colecțiilor sale fratelui său, Wilhelm, care devenise un filolog remarcat și oamenilor de știință francezi; din păcate, blocada continentală aplicată atunci de navele britanice a împiedicat cea mai mare parte a corespondenței sale să ajungă la destinație.