rezumat

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), este o plantă medicinală utilizată în mod tradițional în Europa pentru tratamentul diferitelor tulburări de sănătate, în special ca spălare de ochi pentru tratarea afecțiunilor oculare, cum ar fi conjunctivita și blefarita, care pot fi asociate cu infecții bacteriene. Unele specii de Eufrazie au fost raportate anterior că conțin ulei esențial. Cu toate acestea, compoziția și bioactivitatea uleiului E. rostkoviana sunt necunoscute. Prin urmare, în acest studiu, am investigat compoziția chimică și activitatea antimicrobiană a uleiului esențial eyebright împotriva unor organisme asociate cu infecții oculare: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa și Candida albicans. Analiza GC-MS a evidențiat peste 70 de constituenți, cu acidul n-hexadecanoic (18,47%) ca principal constituent urmat de timol (7,97%), acid miristic (4,71%), linalool (4,65%) și anetol (4,09%). Uleiul esențial a prezentat un efect antimicrobian împotriva tuturor organismelor testate, cu excepția P. aeruginosa. Cea mai bună activitate a fost observată împotriva tuturor bacteriilor Gram-pozitive testate cu concentrații minime inhibitorii de 512 hectolitri/mL. Acesta este primul raport privind compoziția chimică a uleiului esențial E. rostkoviana și activitatea sa antimicrobiană.

1. Introducere

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), a fost folosit în Europa de secole ca un medicament tradițional pentru tratamentul diferitelor boli. Decocțiile și infuziile de părți aeriene înflorite sunt utilizate împotriva tusei uscate, răgușelii, tratamentului simptomatic al răcelii, durerilor de urechi și durerilor de cap, febrei fânului, leziunilor pielii purulente sau bolilor catarre ale tractului intestinal, dar mai ales ca spălare a ochilor pentru tratarea și prevenirea tulburărilor oculare, cum ar fi conjunctivita, blefarita, oboseala ochilor, inflamația oculară purulentă și sties . Utilizarea ceaiului eyebright a fost, de asemenea, raportată în medicina etnoveterinară pentru tratamentul infecției ochilor de vacă . În ciuda secolelor de utilizare tradițională pentru tratamentul afecțiunilor oculare, a existat un singur studiu prospectiv de cohortă efectuat care confirmă eficacitatea picăturilor de ochi Euphrasia în tratamentul conjunctivitei și un singur studiu clinic care investighează efectul aplicării locale a picăturilor oculare asupra consumului de antibiotice la nou-născuți . Mai mult, până la rapoartele recente privind activitatea anticandidală și antibacteriană a unor extracte de Eufrazie, spectrul acțiunii antimicrobiene a fost complet necunoscut.

efectul terapeutic al E. rostkoviana poate fi atribuită în principal activității sale antioxidante, antiinflamatorii și antimicrobiene . Printre compușii identificați anterior în extractele de E. rostkoviana, apigenina, luteolina, kaempferolul, quercetina, acidul cafeic, acidul cumaric și acidul rosmarinic pot fi responsabili pentru acțiunea antimicrobiană. Deși prezența uleiului esențial (EO) în E. officinalis L. și E. stricta Kunt a fost raportată anterior, compoziția și bioactivitatea E. rostkoviana EO sunt necunoscute. Prin urmare, în acest studiu, am investigat compoziția chimică și activitatea antimicrobiană a eo eyebright împotriva grupului de trei bacterii Gram-pozitive (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus și S. epidermidis) și trei bacterii Gram-negative (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae și Pseudomonas aeruginosa) și o drojdie (Candida albicans), organisme frecvent asociate cu infecții oculare.

2. Material și metode

2.1. Produse chimice și materiale vegetale

standardele autentice borneol, camfor, carvacrol, carvone, caryophyllene, p-cymene, estragol, eucaliptol, limonen, linalool, mentol, menthone, VIII-myrcene, VIII-terpinene și timol pentru identificarea componentelor EO, precum și antibioticele de control ciprofloxacin și tioconazol au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (Praga, Republica Cehă). Hexanul (Merck, Praga, Republica Cehă), dimetil sulfoxidul (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Republica Cehă) și Tween 80 (Sigma-Aldrich, Praga, Republica Cehă) au fost utilizate ca solvenți. Materialul vegetal utilizat pentru distilarea OE a fost achiziționat din surse comerciale (F-DENTAL, Hodon, Republica Cehă). EO a fost extras prin hidrodistilare folosind aparate de tip Clevenger.

2.2. Analiza chimică a EO prin cromatografie gazoasă-spectrometrie de masă (GC-MS)

E. rostkoviana EO a fost analizată de GC-MS utilizând detectorul de masă Agilent 7890a GC cuplat la detectorul de masă monocadrupol Agilent 5975c echipat cu o coloană HP-5ms (film de 30 m 0,25 mm, 0,25 mm) de la Agilent (Santa Clara, CA, SUA). Hexanul a fost utilizat ca solvent, iar volumul probei de 1 hectolitru a fost injectat în modul split (raport 20 : 1) în injectorul încălzit la 250 CTC.temperatura cuptorului de pornire a fost setată la 60 CTC timp de 3 min, programată la 230 CTC la o viteză de 3 CTC/min, și apoi menținută constantă timp de 10 min. Heliul a fost utilizat ca gaz purtător cu un debit de 1 mL/min. Analiza SM a fost efectuată în modul de scanare completă, iar energia de ionizare a electronilor a fost setată la 70 eV. Identificarea componentelor individuale s-a bazat pe compararea spectrelor de masă și a indicilor de retenție relativă cu biblioteca Institutului Național de standarde și Tehnologie (NIST, SUA) și literatură , precum și pe coinjecția standardului autentic.

2.3. Tulpini bacteriene și medii de cultivare

tulpinile standard de trei bacterii Gram-pozitive Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 și S. epidermidis ATCC 12228, trei bacterii Gram-negative Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 și Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 și o drojdie Candida albicans ATCC 10231 au fost obținute din Oxoid (Basingstoke, Regatul Unit). Bulionul Mueller-Hinton ajustat cu cationi (MHB) și bulionul de dextroză Sabouraud (SDB) au fost utilizate ca medii de cultivare pentru testul de microdiluție antibacterian și respectiv antifungic și au fost echilibrate cu soluție salină tamponată cu Tris (Sigma-Aldrich, Praga, Republica Cehă). Agar Mueller-Hinton (MHA) și Agar Sabouraud dextroză (SDA) au fost utilizate pentru determinarea ulterioară a concentrațiilor bactericide și, respectiv, fungicide. Toate mass-media au fost achiziționate de la Oxoid (Basingstoke, Marea Britanie).

2.4. Determinarea concentrației minime inhibitoare (CMI)

CMI au fost determinate folosind metoda de microdiluție a bulionului in vitro, urmând liniile directoare ale Institutului de standarde clinice și de laborator (CLSI) modificate conform recomandărilor propuse pentru evaluarea eficientă a potențialului antiinfecțios al produselor naturale folosind plăci de microtitrare cu 96 de godeuri. Pe scurt, OE a fost dizolvată în DMSO cu adaos de Tween 80 și diluții seriale de două ori au fost preparate în MHB pentru bacterii și în SDB pentru drojdie, în timp ce concentrațiile testate au variat de la 4 la 2048 octogon/mL. Inoculul a fost preparat din culturi overnight, astfel încât concentrațiile inițiale ale UFC în microplăci au fost de 5% 105, respectiv 2% 103 UFC / mL pentru bacterii și drojdii. Plăcile inoculate au fost examinate după 24 de ore de incubare la 35 de ore C și încă o dată după 48 de ore în cazul C. albicans. Creșterea microbiană a fost măsurată spectrofotometric prin fotometru cu microplacă Multiscan Ascent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, SUA) la 405 nm. CMI au fost exprimate ca fiind cele mai scăzute concentrații capabile să inhibe 80% din creșterea bacteriană comparativ cu controlul pozitiv al creșterii. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare în trei teste independente, iar valorile medii au fost utilizate pentru calculul MICs. Datorită posibilității raportate recent de influență a componentelor volatile EO asupra creșterii microbiene în puțurile alăturate , au fost inserate rânduri pozitive de control al creșterii între rândurile de diluare EO pentru a detecta eventuala influență a creșterii. Solvenții utilizați nu au inhibat creșterea bacteriană la concentrațiile testate. Ciprofloxacina și tioconazolul au fost utilizate ca antibiotice de referință pentru bacterii și, respectiv, drojdie.

2.5. Concentrația bactericidă minimă (MBC) și concentrația fungicidă minimă(MFC) determinarea

alicotele de 20 ecql au fost transferate din fiecare godeu fără creștere microbiană în plăcile MHA (plăci SDA pentru C. albicans) după 24 h și 48 h de incubare a bacteriilor și, respectiv, a drojdiei testate. Plăcile au fost apoi incubate timp de 24 de ore la 35 C. MBC și MFC au fost evaluate ca o scădere cu 99,9% a CFU în comparație cu inoculul, toate efectuate în trei exemplare în trei teste independente.

3. Rezultate și discuții

3.1. Caracterizarea chimică a uleiurilor și a constituenților fracțiilor Bioactive

hidrodistilarea OE de către aparatul de tip Clevenger a produs 0,02% (g/v) de ulei brun-gălbui care tinde să se solidifice la temperatura camerei, ceea ce este probabil cauzat de o proporție mare de acizi grași (32,23% în total). Analiza GC-MS a OE a evidențiat prezența a peste 70 de constituenți, acidul palmitic (18,47%) fiind cel mai abundent component urmat de timol (7,97%), acid miristic (4,71%), linalool (4,65%), anetol (4,09%), acid linolenic (3,81%), hexahidrofarnesil acetonă (3,16%), acid lauric (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.

Peak number Component RI Area (%) ID Peak number Component RI Area (%) ID 1 1-Hexanold — 0.10 a 41 Damascenone 1385 0.56 a, b 2 1-Octen-3-ol 981 1.82 a, b 42 Methyl eugenol 1406 0.23 a, b 3 β-Myrcene 992 0.14 a, b, c 43 Caryophyllene 1419 1.28 a, b, c 4 3-Octanol 996 0.13 a, b 44 Geranyl acetone 1455 0.89 a, b 5 p-Cymene 1027 0.81 a, b, c 45 Trans-β-farnesene 1460 0.13 a, b 6 Limonene 1032 0.34 a, b, c 46 Alloaromadendrene 1462 0.12 a, b 7 Eucalyptol 1034 0.25 a, b, c 47 γ-Muurolene 1478 0.25 a, b 8 γ-Terpinene 1062 0.34 a, b, c 48 Germacrene D 1482 0.31 a, b 9 Sabinene hydrate 1070 0.14 a, b 49 Curcumene 1484 1.21 a, b 10 1-Octanol 1074 0.40 a, b 50 Trans-β-ionone 1487 1.53 a, b 11 3,5-Octadienoned 1094 0.16 a, b 51 Valencene 1493 0.13 a, b 12 Linalool 1101 4.65 a, b, c 52 α-Selinened 1495 0.17 a, b 13 α-Thujone 1106 0.88 a, b 53 Epizonarened 1498 0.26 a, b 14 β-Thujone 1118 0.48 a, b 54 α-Muurolene 1500 0.18 a, b 15 Camphor 1146 1.00 a, b, c 55 β-Bisabolene 1510 0.94 a, b 16 Menthone 1156 1.98 a, b, c 56 γ-Cadinene 1515 0.40 a, b 17 2-Nonenal, (E)- 1163 0.10 a, b 57 Nerolidold 1566 0.10 a, b 18 Borneol 1168 2.39 a, b, c 58 Lauric acid 1574 2.79 a, b 19 (+/−)Lavandulol 1170 0.16 a, b 59 Spathulenol 1578 0.61 a, b 20 Menthol 1175 2.02 a, b, c 60 Caryophyllene oxide 1583 1.47 a, b 21 4-Terpineol 1179 1.13 a, b 61 Pseudoiononed 1587 0.18 a, b 22 α-Terpineol 1191 2.39 a, b 62 Humulene epoxide II 1609 0.25 a, b 23 Estragole 1199 0.34 a, b, c 63 Longifolenaldehyded 1613 0.20 a, b 24 Decanal 1207 0.15 a, b 64 τ-Cadinol 1643 0.18 a, b 25 β-Cyclocitrald 1222 0.21 a, b 65 β-Eudesmol 1651 0.13 a, b 26 Thymol methyl ether 1238 0.75 a, b 66 Myristic acid 1771 4.71 a, b 27 Cumin aldehyde 1242 0.23 a, b 67 Hexahydrofarnesyl acetone 1847 3.16 a, b 28 Neral 1244 0.14 a, b 68 Pentadecanoic acid 1865 0.28 a, b 29 Carvone 1246 1.28 a, b, c 69 Farnesyl acetone 1919 0.50 a, b 30 Piperitone 1256 0.18 a, b 70 Palmitic acid 1977 18.47 a, b 31 Geraniol 1258 0.79 a, b 71 Phytold 2114 0.12 a, b 32 Trans-2-decenald 1264 0.11 a, b 72 Linoleic acid 2143 1.90 a, b 33 Geranial 1273 0.15 a, b 73 Linolenic acid 2148 3.81 a, b 34 Anethole 1287 4.09 a, b 74 Tricosane 2300 1.79 a, b 35 Safrole 1289 0.21 a, b 75 Tetracosane 2400 0.16 a, b 36 Thymol 1295 7.97 a, b, c 76 Pentacosane 2500 1.36 a, b 37 Carvacrol 1304 1.96 a, b, c 38 (E,E)-2,4-Decadienal 1318 0.21 a, b Total identified 98.91 39 Capric acid 1374 0.26 a, b 40 α-Copaene 1377 0.15 a, b

R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identificarea pe baza coinjecției eșantionului autentic; d: identificare provizorie.

Tabelul 1

compoziția chimică a uleiului esențial Euphrasia rostkoviana Hayne.

Figura 1

cromatograma tipică a uleiului esențial Euphrasia rostkoviana. Componentele principale sunt etichetate în funcție de ordinea timpilor de retenție. (12) Linalool; (22)-terpineol; (34) anetol; (36) timol; (37) carvacrol; (58) acid lauric; (66) acid miristic; (67) hexahidrofarnesil acetonă; (70) acid palmitic; (73) acid linolenic.

conținutul ridicat de acizi grași a fost găsit anterior în E. stricta EO (25,7% în total), de asemenea, cu cea mai mare proporție de acid palmitic (20,3%) și acid miristic (3,9%) . Cu toate acestea, nu există niciun alt compus prezent în cantitate semnificativă care să indice legătura acestor două specii de Eufrazie.

3.2. Activitatea antimicrobiană

E. rostkoviana EO a prezentat activitate împotriva a șase din șapte organisme testate cu mic-uri cuprinse între 512 și 2048 hectog/mL. Bacteriile Gram-pozitive au fost mai sensibile decât cele Gram-negative și drojdia, în timp ce P. aeruginosa a fost singurul organism care nu a fost inhibat de ulei la cele mai mari concentrații testate. MICs, MBCs și MFC ale EO împotriva tuturor microorganismelor testate sunt rezumate în tabelul 2. Concentrațiile active sunt comparabile cu cele raportate anterior, de exemplu, pentru EOs de Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum sau Thymus vulgaris, în special în cazul activității anticandidale . Uleiul a fost, de asemenea, mai eficient decât extractele de E. rostkoviana testate de Teixeira și Silva împotriva E. coli, E. faecalis, S. aureus și S. epidermidis. Microfoanele antibioticelor de referință împotriva bacteriilor și drojdiei sensibile la E. rostkoviana EO au fost în conformitate cu limitele acceptabile CLSI și rapoartele anterioare, respectiv .

Microorganism Euphrasia rostkoviana EO CIP TIO MIC (µg/mL) IC50 (µg/mL) MBC/MFC (µg/mL) MIC (µg/mL) MIC (µg/mL) 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 24 h 48 h Enterococcus faecalis 512 — 128 — 1024 0.5 — Staphylococcus aureus 512 — 128 — >2048 0.5 — Staphylococcus epidermidis 512 — 256 — >2048 0.25 — Klebsiella pneumoniae 2048 — 1024 — >2048 0.125 — Escherichia coli 2048 — 1024 — >2048 0.015 — Pseudomonas aeruginosa >2048 — >2048 — >2048 0.125 — Candida albicans 128 1024 128 1024 2048 — 0.063

The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration.

Table 2

The inhibitory and cidal concentrations of E. rostkoviana essential oil.

deoarece conținutul principalului component eo acid palmitic nu depășește 20% și există mai mult de 10 alți compuși antimicrobieni activi variind de la 1 la 8%, este dificil să se sugereze principalii agenți responsabili de efectul antimicrobian E. rostkoviana EO. Acidul Palmitic a fost identificat anterior ca principalul compus al fracțiilor active împotriva bacteriilor Gram-negative, dar nu Gram-pozitive . Pe de altă parte, se știe că acizii grași saturați cu lanț mediu și acizii grași nesaturați cu lanț lung inhibă în special bacteriile Gram-pozitive . Mai mult, acidul lauric exercită și activitate împotriva unui număr de ciuperci . Astfel, activitatea antimicrobiană a OE se datorează probabil unei acțiuni complexe a acizilor grași antimicrobieni cu ceilalți compuși antimicrobieni cunoscuți identificați în OE, cum ar fi anetolul, borneolul, camforul, carvacrolul, linalolul, mentolul, terpineolul sau timolul.

4. Concluzii

în concluzie, analiza chimică a evidențiat o serie de substanțe antimicrobiene active prezente în E. rostkoviana EO și activitatea sa antifungică și antibacteriană împotriva bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative a fost confirmată. Din câte știm, acesta este primul raport privind compoziția și activitatea antimicrobiană a E. rostkoviana EO.

Conflict de interese

autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.

mulțumiri

această lucrare a fost susținută financiar de Fundația Europeană pentru științe și Ministerul Educației, Tineretului și Sportului din Republica Cehă proiect CZ.1.07/2.3.00/30.0040; prin s-grant al Ministerului Educației, Tineretului și Sportului din Republica Cehă; și de către Universitatea cehă de științe ale vieții Praga proiect IGA 20155012. Autorii sunt recunoscători Slavka Barlakova pentru corectura engleză.