efectul citopatic (CPE): cum scapă virușii cu crima

virușii, prin definiție, sunt invizibili pentru ochii noștri. Sunt nanostructuri care pot deveni vizibile doar folosind microscopia electronică, o tehnică care consumă mult timp și nu este accesibilă tuturor. În consecință, un virolog trebuie să găsească alternative pentru a putea lucra și studia obiectul său de interes. Un mod practic de a” vedea ” și de a măsura indirect o infecție virală este prin analizarea daunelor pe care un virus le provoacă unei celule. Această suferință sau deteriorare este cunoscută sub numele de efect citofatic (CPE), iar măsurarea sa este utilizată pe scară largă în laboratoarele de virologie din întreaga lume.CPE este o abordare foarte de bază pentru a înțelege modul în care un virus infectează o celulă, dar asta nu înseamnă că este folosit doar în cercetarea științifică de bază. Măsurarea CPEs poate fi, de asemenea, o citire foarte utilă pentru companiile farmaceutice și laboratoarele de diagnosticare.

ce este efectul citofatic indus de virus?

virușii sunt paraziți care au nevoie de o celulă gazdă pentru a se reproduce. Odată ajunși în celulă, ei deturnează mașinile celulare pentru a-și produce propriile proteine, acid nucleic și membrană (atunci când este necesar). deoarece virusul ocupă factori celulari care sunt altfel utilizați de celulă, replicarea sa poate modifica funcțiile de bază ale celulelor gazdă sau chiar o poate distruge. Setul de modificări celulare sau modificări rezultate dintr-o infecție virală sunt cunoscute sub numele de CPEs. Acestea sunt de obicei modificări negative care pot provoca modificări structurale, metabolice sau funcționale în celula care este infectată. În timp, CPEs poate da naștere la efectele patologice ale virusului (boala).

exemple clasice ale efectului citopatic

un virus indus-CPE bine-cunoscut este moartea celulelor (a se vedea un video de o celulă pe moarte în ). Mulți viruși ucid celulele fie prin liză, fie prin inducerea apoptozei. De exemplu, HIV este cunoscut pentru uciderea limfocitelor T CD4+, care este principalul motiv pentru care persoanele infectate devin imunocompromise.

în laborator, o modalitate ușoară de a ucide o linie celulară de țânțari (cum ar fi C6 / 36) sau celulele Vero este prin infectarea acesteia cu orice arbovirus celebru, cum ar fi Chikungunya, Dengue sau Zika. După câteva zile de infecție, celulele se destramă chiar în fața ochilor (Fig. 1).

Figura 1 / celulele Vero au fost infectate cu virusul Zika. După 72 de ore de infecție, un CPE clar este evident prin prezența debri celulare ca urmare a morții celulare.

Un alt exemplu CPE este formarea syncytia. Celulele infectate cu viruși înveliți exprimă proteine virale pe membrana lor plasmatică, care sunt utilizate de viruși pentru a media fuziunea cu celula gazdă. Când aceste proteine virale se leagă de receptorii de pe suprafața celulelor vecine, are loc fuziunea celulă–celulă, rezultând formarea sincitiei (celulă gigant multinucleată).

virusul sincițial respirator (RSV) este cauza majoră a pneumoniei virale la copiii mici. Numele său este derivat din faptul că poate forma sincitia în cultura celulară, dar, remarcabil, și în plămânii pacienților infectați. modificările legate de CPE în morfologia celulelor includ, de asemenea, rotunjirea, detașarea și/sau aglomerarea celulelor aderente. În acest caz, celulele infectate rămân active metabolic pentru a reproduce virusul, dar citoscheletul lor este modificat. Modificările morfologice pot fi explicate printr-o reglare în jos a expresiei proteinelor de aderență la suprafață ca urmare a infecției. Virusul Ebola, de exemplu, este cunoscut pentru a provoca modificări morfologice dramatice în celulele aderente prin scăderea expresiei integrinei inkts1.

chiar ai nevoie de atât de multă dramă (moarte, gigantism, deformare) pentru a fi considerată un CPE? Nu. Celulele se pot „comporta” diferit atunci când sunt infectate, dar arată la fel. Modificările de tip CPE mai subtile, dar încă clare, pot include modificarea ratei de creștere/cinetică, modificări ale unei anumite activități metabolice sau modificări ale funcției celulare. Printre diferitele virusuri care pot induce aceste tipuri de CPEs se numără virusul Zika. În 2015, acest virus transmis de țânțari a fost peste tot în știri, deoarece provoacă microcefalie, o leziune neurologică severă caracterizată printr-o dimensiune redusă a creierului la fetuși. Mai târziu s-a descris că microcefalia este rezultatul mai multor efecte citopatice induse de Zika asupra celulelor neuronale, inclusiv hipertrofia celulară, restricția de creștere, dereglarea ciclului celular și moartea celulelor. Un test de formare a coloniilor a fost utilizat, de exemplu, pentru a identifica care dintre diferitele proteine Zika interferează cu proliferarea celulelor.

pentru cercetătorii care compară sistematic cinetica de creștere a liniilor celulare, recomandăm Cytosmart Omni. Imagini cinetice cu celule vii ale puțurilor întregi, folosind software automat de scanare și coasere a imaginilor. Imagine plăci pline de bine timp de ore până la săptămâni la un moment dat.

efectele Citopatice sunt rezultatul interacțiunilor virus-gazdă

este important de menționat că CPE nu este definit doar de virus, ci și de celula gazdă. Depinde de cât de permisive sunt celulele la infecție. Fiind o celulă permisivă, una care poate susține creșterea unui virus. Cu alte cuvinte, nu toți virușii pot infecta toate tipurile de celule. Pentru a păstra simplu, putem spune că:

• Nu permisiv Cell – Virus nu poate infecta
• permisiv Cell – Virus poate reproduce, dar nu provoacă evident CPE
• extrem de permisiv cell – Virus reproduce și induce un evident CPE

deci, dacă adăugați virus la celulele și nu se întâmplă nimic, nu vă faceți griji. Trebuie doar să găsiți combinația potrivită virus-celulă.

citiri – cum se măsoară CPE?

modificările celulare induse de Virus, cum ar fi moartea celulară sau o morfologie modificată, sunt vizibile prin microscopie luminoasă. Puteți pune farfuria sub un microscop inversat standard și puteți vedea dacă celulele dvs. au murit sau s-au schimbat cumva. Un aspect pozitiv al acestei abordări este că este „ușor”, deoarece nu necesită nicio prelucrare a eșantionului, ceea ce evită fixarea sau colorarea artefactelor.

pe dezavantaj, este calitativ și nu cantitativ, și se bazează foarte mult pe formarea observatorului. În zilele noastre, această abordare poate fi automatizată prin monitorizarea în timp real a citopatogenezei induse de virus. De exemplu, modificările virale ale răspândirii și proliferării celulare pot fi evaluate printr-un test de vindecare a rănilor, unde viteza de migrare colectivă și unică a celulelor poate fi detectată împreună cu modificări severe ale morfologiei celulare. O altă abordare cantitativă este monitorizarea proliferării celulare prin analiza automată a imaginii. Cu această tehnologie este posibil să se genereze curbe de creștere a VS infectate. culturi de celule neinfectate pentru a cuantifica corect efectul citopatic pe care îl poate avea o infecție cu virus.

dacă celulele moarte sunt ceea ce vă fac ziua, o alternativă este celebrul test de placă. Această tehnică clasică de virologie este utilizată pentru a cuantifica particulele virale infecțioase și se bazează pe principiul că virușii pot induce liza celulară. După infectarea unui monostrat de celule foarte permisive, celulele sunt contracarate cu violet de cristal (celulele vii sunt colorate, celulele morții rămân nepătate), rezultând plăci frumoase (zone ale celulelor morții) care pot fi ușor cuantificate cu ochiul liber.

dar nu trebuie să vă vedeți celulele pentru a ști că sunt moarte. Viabilitatea celulară postinfecția poate fi măsurată prin cuantificarea concentrației intracelulare de ATP cu licurici luciferază sau cu testul MTT tradițional.

lucrul cu viruși poate fi o problemă, laboratoarele BSL-3/4 au măsuri stricte de securitate și intrarea și ieșirea din laborator necesită mult timp. Pentru cercetătorii care caută o soluție pentru a-și monitoriza celulele, fără a fi nevoie să intre în laborator, vă recomandăm să consultați kitul Cytosmart Lux2 Duo.

Aplicații

virusul tău induce un CPE? Îl puteți vedea sau măsura clar? Grozav! Puteți utiliza acest CPE ca citire a unei infecții virale de succes sau replicare. Un CPE dat poate servi ca indicator pentru a afla cum să preveniți o infecție, pentru a caracteriza factorii gazdă sau patogeni necesari pentru ca o infecție să aibă loc, pentru a identifica tropismul virusului, printre altele. În termeni practici, acest lucru înseamnă că poate fi folosit ca citire pentru:

• Screening-ul și evaluarea compusului antiviral
  poate un candidat la medicament să prevină formarea CPE?
• Screening pentru anticorpi neutralizanți
  poate un anticorp dat să inhibe CPE indus de virus?
• supravegherea rezistenței la medicamente antivirale (fenotipare)
  poate un izolat de virus dat să inducă CPE în prezența medicamentelor antivirale?
• caracterizarea tropismului virusului
  Ce tipuri de celule sunt infectate preferențial de un virus? De ce? (Verificați o publicație recentă cu infamul SARS-CoV-2 în .)
• diagnosticul bolilor virale
  este un virus care infectează activ o persoană? Specimenul clinic este colectat de la acea persoană care induce CPE? Să ținem cont de faptul că majoritatea metodelor de diagnostic (Elisa, RT-qPCR) nu detectează particule virale infecțioase.

pentru a concluziona…

deși există mai multe modalități de măsurare a infecției cu virus, verificarea CPEs în celulele permisive rămâne o alternativă larg utilizată. Pentru a fi cu adevărat util, trebuie să găsiți combinația potrivită: un virus, o celulă permisivă și o citire exactă. Odată ce găsiți această combinație, aplicațiile pot fi destul de diverse și utile fie într-un cadru academic, în industrie, fie în diagnosticul clinic.

Aflați despre toate soluțiile de imagistică CytoSMART aici