cinci variante Pax-6 și modelele lor de exprimare în embrioni de calmar și țesuturi oculare adulte

am efectuat un singur PCR de 3′-rasă pentru gena pax-6 de calmar pigmeu (desemnată ca IpPax-6) pentru cefalopode coleoide. Am constatat că nu au existat loci multipli în calmarul pigmeu, dar am identificat trei variante Pax-6 de lungimi discrete. Diferențele în secvențele de aminoacizi dintre aceste variante Pax – 6 au fost limitate la regiuni limitate. Prin urmare, s-a presupus că acestea sunt rezultatul unor evenimente alternative de îmbinare a unui singur locus. În continuare am validat prezența variantelor de îmbinare folosind RT-PCR și am obținut în final cinci tipuri de variante de îmbinare, inclusiv un ortolog aparent de pax-6 autentic (Figura 1). Lungimea și structura IpPax-6 autentice au fost similare cu cele ale genelor Pax-6 găsite la alte specii de calmar, scolopii Euprymna și Loligo pealei15,16. IpPax-6 autentic (forma autentică, 499 aa) cuprinde două domenii independente de legare a ADN-ului, domeniile PD și HD și un domeniu C-terminal P/S/t-rich (PST), care este activatorul dedicat cu o proteină trans-Activatoare parteneră, așa cum se arată la multe animale (Figura 1). Atât similitudinea secvenței proteice, cât și arborele filogenetic au confirmat că IpPax-6 a fost un ortolog al muștei EY și al vertebratelor Pax-4/6 (figura suplimentară 1). Cele patru variante identificate au produs proteine cu lungimi diferite de cele ale ippax-6 autentic (Figura 1).

pentru a explora expresia specifică etapei variantelor squid Pax-6, am efectuat Q-PCR pentru diferite țesuturi și în diferite stadii embrionare folosind primeri concepuți pentru a viza exonii suplimentari ai IpPax-6 (Figura 2 & figura S2). Ouăle de calmar prezintă gastrulare epibolică și dezvoltare directă fără stadii larvare tipice de moluște17. Ochii embrionari apar din epidermul extern al blastodiscului și sunt diferențiați după stadiul 18, pigmentarea retinei începând cu stadiul 20. Obiectivul apare ca o structură transparentă, asemănătoare unui băț, vizibilă cu ochiul liber în etapa 25. Am efectuat mai întâi Q-PCR folosind primeri care vizează exonul 2, care acoperă toate cele cinci variante. Analiza Q-PCR a arătat că IpPax-6 a fost exprimat în stadiul 16 înainte de formarea veziculelor oculare (figura 2a). Intensitatea expresiei IpPax – 6 a fost reglată treptat odată cu dezvoltarea embrionului de calmar (figura 2a), globul ocular prezentând cele mai mari intensități de Expresie dintre țesuturile testate. După cum s-a observat la celelalte animale bilaterale, formele autentice și variante ale IpPax-6 au fost exprimate la niveluri semnificativ deprimate în țesutul muscular. Apoi am folosit primeri care vizează variante lipsite de exon 4 (variantele 1 și 3, figura 2b). Primerii au detectat variantele 1 și 3 la niveluri scăzute în embrioni în stadiul 16 și în țesutul globului ocular. De asemenea, am folosit primeri care vizează variante, inclusiv exonul 6 (variantele 2 și 3, figura 2c). Analiza Q-PCR a arătat că variantele 2 și 3 au fost exprimate în globii oculari și lobii optici, precum și în embrioni în stadiile 16 și 25. Deoarece formarea celulelor fotoreceptoare și a cristalinului începe în embrioni în stadiul 25, variantele inclusiv exonul 6 pot contribui la dezvoltarea ochilor. Rezultatele demonstrează că modelele de Expresie ale variantelor IpPax-6 diferă semnificativ de cele ale ippax-6 autentice.

pentru a distinge care variante sunt prezente în fiecare etapă, am efectuat RT-PCR folosind seturi de grunduri peste limitele exonului. Varianta 1 a fost considerată a fi exprimată în toate / unele stadii embrionare, dar nu și în ochii adulților (figura suplimentară 2). Analiza RT-PCR a arătat, de asemenea, că varianta 4 a fost puternic exprimată în ochii adulților, în special în retină, dar nu și în lentile (figura suplimentară 2a). Variantele 2 și 3 au fost exprimate în toate stadiile embrionare și, de asemenea, în țesuturile adulte (figura suplimentară 2b).

pentru a identifica expresia specifică țesutului variantelor IpPax-6, am efectuat hibridizarea in situ folosind sonde ARN concepute pentru a se lega specific de fiecare variantă (figura 2D-G). Sonda ARN proiectată din exonul 2 vizează toate cele cinci variante identificate în acest studiu. Sonda ARN proiectată din exonul 4 legată de forma autentică și de variantele 2 și 4. S-a constatat că IpPax–6 este localizat în zona creierului, incluzând lobul bazal dorsal, lobul frontal superior, pedunculul/lobii olfactivi și lobii optici (figura 2D-G), așa cum este descris în Hartmann și colab.18 țesutul din afara retinei (probabil corespunzător viitorului strat iridofor) a exprimat clar și IpPax-6 în stadiul 22 (figurile 2D și 2D’). Expresia IpPax – 6 a fost observată în acest strat până în stadiul 25. Hibridizarea in situ utilizând sonda care vizează exonul 4 a sugerat că variantele 2 și 4 au modele de Expresie similare în creier, dar nu și în ochi (figura 2e). Această constatare sugerează că variantele 1 și 3 (lipsite de exonul 4) sunt reglate în sus în stratul exterior al ochilor. Aceste consecințe implică faptul că fiecare variantă IpPax-6 este reglată independent în procesele de formare a ochilor.

structura Exon-intronică a Pax-6 la alte cefalopode/moluște

am investigat dacă acest tip de îmbinare alternativă a fost dobândit numai la cefalopodele coleoide. Aplicând analiza RT-PCR la ARN-urile embrionare japoneze (Loligo bleekeri), am găsit trei tipuri de ARNm posibil derivate din îmbinarea alternativă (Exon 4 sărind peste, Exon 3 inserție și Exon 6 inserție) în ochi (figura 3a, B). Exonii introduși 3 și 6 au codificat 20 și, respectiv, 40 de aminoacizi, în timp ce exonul omis 4 a codificat 51 de aminoacizi. Pentru a studia prezența unei îmbinări alternative similare în alte genomi de moluște, am examinat structurile exon-intron ale Pax-6 în bufnița și stridia perlată. Secvența completă a genomului bufniței limpet (Lottia gigantea, obținută din portalul genomului JGI Lotgi V1.0, E_gw1.86.103.1)19 și a stridiei de perle (Pinctada fucata, obținută din browserul genomului unității Marine de Genomică Oist P. fucata_ver1.0, transcriere: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, schela 8418.1) 20 a arătat că molluscan Pax-6 are cinci exoni. Exonul 4 din calmar a fost conservat la speciile de moluște testate. Cu toate acestea, exonii 3 și 5 nu au fost găsiți în gena pearl oyster Pax-6. Astfel, am constatat că formele variante 2 și 4 au fost dobândite în linia cefalopodului coleoid (Figura 1).

Din câte știm, studiul nostru este primul care raportează variante de îmbinare în cadru ale calmarului Pax-6 care au fost exprimate diferit în funcție de stadiul embrionar. Studiile anterioare au izolat tipuri discrete de variante de îmbinare care au pierdut jumătatea N-terminală a domeniului PD la alte specii de calmar15,18, dar aceste variante nu au prezentat diferențe spațio-temporale de Expresie. Studiul nostru a sugerat, de asemenea, că mecanismele care stau la baza dobândirii variațiilor în transcrierile Pax-6 prin îmbinare alternativă au fost dobândite în mod unic în linia cefalopodului coleoid, deoarece moluștele inferioare, cum ar fi bivalvele, nu posedă un fragment asemănător exonului corespunzător în genomul lor.

funcția variantelor squid Pax-6 și rolul lor presupus în dezvoltarea ochilor

adăugarea și ștergerea unui fragment de aminoacid codificat în exonii utilizați alternativ este de așteptat să provoace modificări structurale în variantele proteinei IpPax-6, care le pot modifica funcția în procesul de dezvoltare. Două dintre variantele sale (variante 1 și 3) lipsa unui 153mer în mijlocul autentic Pax-6 și jumătate din HD (Figura 1). Pentru a explora dacă ștergerea influențează proprietățile lor funcționale, am efectuat predicții structurale tridimensionale (3D) ale proteinelor pe baza modelării comparative. Au fost construite structurile 3D presupuse ale HD-urilor IpPax-6 autentice și varianta lipsită de segmentul codificat de exon 3. Structura șablonului a fost identificată prin forma legată de ADN, astfel încât să putem prezice structura IpPax-6 și varianta în forma legată de ADN. Structura 3D presupusă a formei autentice a fost destul de bine modelată; reziduurile de bază, și anume, Phe pe bucla înainte de prima helix a HD, Leu pe prima helix, Leu pe a doua helix și Trp și Phe pe a treia helix a structurii modelului, au fost conservate și cele trei helice ale HD au fost aparent strâns împachetate una în cealaltă (figura 3c). Reziduurile importante pentru legarea ADN-ului, și anume două reziduuri Arg la brațul n-terminal și reziduurile polare de pe suprafața celei de-a treia spirale, au fost localizate în mod rezonabil aproape de interfața ADN (figura 3c, D). Cu toate acestea, structura 3D presupusă a variantei a prezentat o serie de probleme problematice. În structura modelată, pierderea regiunii codificate de exonul 3, care codifică partea N-terminală a primei spirale, a fost compensată de 15 reziduuri codificate în exonul 2. Astfel, secvențele de aminoacizi ale formelor autentice și variante diferă doar în regiunea care conține cele 15 reziduuri ale laturii n-terminale. Această diferență, totuși, a crescut semnificativ energia structurală a variantei și aparent a destabilizat structura generală. Această instabilitate poate rezulta din lipsa Phe pe buclă înainte de prima helix și a leului pe prima helix. Aceste componente sunt evident importante pentru ambalarea celor trei spirale. În plus, două reziduuri Arg la bucla N-terminală care se leagă de bazele ADN din canelura minoră în forma autentică lipseau în variantă. Aceste probleme de stabilitate și legare a ADN-ului în variantă sugerează cu tărie că HD-ul variantei este instabil și că domeniul are o afinitate mică de legare pentru ADN (figurile 3D și 3D’). Lipsa unui HD stabil sugerează în continuare că variantele 1 și 3 au site-uri țintă ADN diferite de cele ale ippax-6 autentice la speciile de calmar.

două variante (variantele 2 și 3) au prezentat, de asemenea, o inserție de 120 mer în domeniul PST (Figura 1). Secvența inserată s-a dovedit a fi specifică calmarului (Figura 2). Această Inserare ar putea schimba activitățile trans-activare ale domeniului PST. Varianta 4 a arătat o inserție unică (57 mer) între PD și HD. Programul Motif (http://www.genome.jp/tools/motif/) nu a găsit domenii sau semnături cunoscute în secvența inserată. Această inserție alungește un linker între domeniile PD și HD.