ca și în cazul izolării ADN-ului, oamenii de știință se bazează în mod obișnuit pe kituri de izolare ARN pentru a le ușura viața. Recent, am publicat un blog despre purificarea ADN – ului fără un kit care a subliniat mai multe motive pentru care a face ceva fără un kit are avantaje: mai puține deșeuri de plastic, mai puține cheltuieli și mai puțin de a rămâne cu o grămadă de soluții aleatorii atunci când toate coloanele de spin se epuizează. În acest articol, acoperim elementele de bază ale izolării ARN fără un kit.

Sfaturi pentru lucrul cu ARN (indiferent dacă utilizați sau nu un kit)

deși este de la sine înțeles că trebuie să aveți grijă ori de câte ori faceți orice tip de purificare a ADN-ului sau ARN-ului pentru a evita contaminarea, aveți grijă suplimentară atunci când efectuați extracția ARN-ului. ARN – ul nu este în mod inerent la fel de stabil ca ADN-ul-este monocatenar și grupările sale de riboză sunt susceptibile la hidroliză și degradare a căldurii. În plus, ARN-urile sau enzimele care degradează ARN-ul sunt proteine deosebit de rezistente care se găsesc în și pe tot, inclusiv pe pielea ta. Iată câteva sfaturi generale pentru lucrul cu ARN, chiar dacă utilizați un kit:

• purtați întotdeauna mănuși, deoarece Rnazele de pe mâini pot degrada ARN-ul.
• păstrați o zonă de lucru curată, care poate include pulverizarea bancului cu un produs pentru a scăpa de RNases, cum ar fi RNaseZAP.
• când recoltați țesuturi, celule, plante, ciuperci sau bacterii, păstrați probele la rece și lucrați rapid pentru a atenua degradarea ARN-ului.
• asigurați-vă că utilizați apă tratată cu DEPC sau fără Rnază. Dacă utilizați apă tratată cu DEPC, autoclavați apa pentru a inactiva DEPC.
• asigurați-vă că articolele din plastic sau din sticlă utilizate nu conțin RNase. Articolele din plastic fără RNase sunt disponibile imediat de la furnizorii științifici, iar articolele din sticlă trebuie tratate cu o soluție DEPC timp de 1 oră și autoclavate pentru a îndepărta DEPC rezidual. Alternativ, sticlăria poate fi coaptă la 180 de centi C timp de cel puțin 4 ore.
• dacă proba(probele) finală (finale) de ARN sunt omogenizate în apă sau tampon TE, depozitați-le într-un congelator de -80 MMC pentru a preveni degradarea ARN-ului. Acestea se vor degrada într-un congelator de -20 centi C.

metodele de extracție a ARN au evoluat într-un protocol simplu folosit și astăzi

există multe metode alternative pentru izolarea ADN-ului fără un kit. Cu toate acestea, nu este cazul extracției și purificării ARN. Există o metodă simplă care funcționează și variații ale acestei metode. Un obstacol major în dezvoltarea protocoalelor de izolare a ARN-ului a fost că Rnazele se găsesc în mod obișnuit în celule și, fără ceva care să blocheze activitatea Rnazei la liza celulară, ARN-ul este degradat. Pentru a izola eficient ARN – ul intact, ar fi necesar un denaturant proteic rapid și puternic-ceva care a descompus ARN-urile înainte ca ARN-urile să aibă șansa de a descompune ARN-ul la liza celulară.

la sfârșitul anilor 1970, Chirgwin și colegii săi au arătat că un denaturant proteic puternic, tiocianatul de guanidiniu, a făcut exact acest lucru (Chirgwin și colab., 1979). Ei au dezvoltat un protocol destinat izolării ARN-ului din splinele de șobolan în care au omogenizat splinele într-o soluție de tiocianat de guanidiniu și au rotit omogenatul pentru a îndepărta materialul insolubil. Apoi, omogenatul a fost încărcat pe gradienți de clorură de cesiu și ultracentrifugat timp de până la 20 de ore pentru a separa ARN-ul intact de ADN și proteine. Deși este foarte eficientă în izolarea ARN-ului total, această metodă necesită mult timp și, în funcție de câte probe puteți avea, accesul la unul sau mai multe ultracentrifuge mari și scumpe.

Figura 1: o schiță a diferitelor etape în extracția ARN.

cercetatorii de la NIH la mijlocul anilor 1980 stabilit pentru a dezvolta un protocol care omit ultracentrifugare cu totul. Chomczynski și Sacchi au arătat că ARN-ul ar putea fi separat eficient de ADN și proteine printr-un protocol simplu de extracție cu tiocianat de guanidiniu-fenol-cloroform. În această metodă, probele sunt încă omogenizate și lizate într-o soluție de tiocianat de guanidiniu. Cu toate acestea, în loc de separarea ARN folosind gradienți de clorură de cesiu, fenol saturat cu apă, acetat de sodiu și cloroform se adaugă la omogenat și se agită. După o centrifugare rapidă (nu ultracentrifugare!), straturile de fenol și cloroform se separă, iar ARN-ul este reținut în stratul apos superior, în timp ce ADN-ul și alte proteine sunt reținute în stratul organic interfazic și inferior. Stratul apos superior este extras și ARN poate fi apoi precipitat cu izopropanol. Această metodă a redus timpul necesar izolării ARN de la 20+ ore la aproximativ 4 ore, iar variațiile acestei metode fără kit sunt încă utilizate pe scară largă astăzi (Chomcynski și Sacchi, 2006).

vezi protocolul nostru pentru extragerea ARN!

făcând protocolul simplu și mai infailibil (încă fără kit!)

după cum sa menționat mai sus, lucrul cu ARN necesită păstrarea probelor la rece până la omogenizare și liza celulară. Acest lucru poate fi o provocare în funcție de situația dvs. de laborator sau de metoda de colectare a țesuturilor, astfel încât companiile de biotehnologie au comercializat mai multe produse care ajută la eficientizarea în continuare a acestui proces și/sau stabilizarea ARN-ului în timpul colectării și omogenizării țesuturilor. Cel mai cunoscut dintre aceste produse este trizol XV (numit și Tri Reactiv, Rnazol, Qiazol și vândut de multe companii diferite). TRIzol XV este o soluție all-in-one acid-guanidinium-fenol care combină soluția de omogenizare și adăugarea de fenol a protocolului original no-kit într-o singură etapă. După omogenizare în trizol, materialul insolubil este îndepărtat prin centrifugare și supernatantul este extras cu cloroform ca în metoda no-kit de mai sus.

cercetătorii au dezvoltat, de asemenea, modalități de a „stabiliza” ARN-ul în țesuturi înainte de liza celulară. Aceste produse, și anume rnalater de la Thermo și rnaprotect de la QIAGEN, sunt soluții pe bază de sulfat de amoniu care acționează prin inhibarea activității Rnazei în celule sau țesuturi-nu stabilizează chimic moleculele de ARN (Allewell și Sarma, 1974). În plus, ThermoFisher oferă un protocol cu privire la modul de integrare a rnalater-ului cu utilizarea trizol-ului, iar soluțiile de stabilizare a sulfatului de amoniu pot fi realizate în casă.

o problemă obișnuită cu metodele de extracție a ARN-ului fără kit este reportarea ADN-ului care poate complica rezultatele unei aplicații din aval, cum ar fi PCR cantitativ pentru a evalua expresia genelor. Există mai multe lucruri pe care cercetătorii le pot face pentru a combate această problemă. În primul rând, fiți atenți la extracții – dacă aveți nevoie de ARN cu adevărat curat, este important să vă asigurați că atunci când extrageți, să luați doar stratul apos pentru a evita reportarea ADN-ului din stratul organic de jos. Un alt truc este precipitarea ARN-ului folosind clorură de litiu. Soluțiile LiCl precipită selectiv ARN, dar nu ADN și proteine. În cele din urmă, folosind un DNase (există mai multe produse enzimatice DNase pe piață pentru a alege de la) pe proba de ARN resuspendat va ajuta la asigurarea contaminării ADN-ului nu este o problemă.

Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ (1979) izolarea acidului ribonucleic biologic activ din surse îmbogățite În ribonuclează. Biochimie 18: 5294-5299. https://doi.org/10.1021/bi00591a005

Chomczynski P, Sacchi N (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1:581–585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83