informații clinice
Un bărbat chinez în vârstă de 25 de ani (IV-1) căsătorit cu o femeie neconsanguină cu cromozomi normali (IV-2). Acest cuplu a avut un fiu (V-1) care a murit la vârsta de 6 luni fără autopsie. Analiza cromozomială anterioară a indicat că V-1 avea un cariotip 45,XY,der(14;15)(q10;q10). Părinții propositus (IV-1) sunt veri primari fenotipici normali (III-1, III -2). Părinții lor, un unchi reciproc și ambii bunici nu au fost disponibili pentru analiza citogenetică (Fig. 1). Examinarea stării mentale a fost efectuată pe IV-1 de către un psihiatru.
analiza cariotipului
hibridizarea fluorescenței in situ (FISH)
cromozomii spermatozoizi de la pacienții III-1 și IV-1 au fost analizați de FISH. Probele de material seminal au fost evaluate pentru volum, concentrație și motilitate conform criteriilor Organizației Mondiale a sănătății. După analiza materialului seminal, spermatozoizii progresiv mobili au fost izolați și spălați de două ori în soluție salină tamponată cu fosfat (pH 7.4) și centrifugat la 1500 rpm timp de 11 min. Peletele au fost fixate cu 5 ml amestec de acid acetic/metanol (1: 3) timp de cel puțin 30 min la 4 centimetric C. alicote (40-50 centimetric) din suspensia rezultată a nucleelor au fost șterse pe lamele pre-curățate la rece. Decondensarea nucleelor a fost efectuată în 1 n NaOH timp de 2 min. Diapozitivele au fost apoi degradate de o serie de etanol gradat(70 %, 90 %, 100 %) și denaturat cu 0,25% formamidă în 2xssc urmată de hibridizarea peste noapte cu o combinație de sonde disponibile în comerț. În acest studiu au fost utilizate două seturi de amestecuri de sonde. Peștele cu două culori a fost realizat folosind sonde locusspecific (LSP) și sonde Tel de la Visis (Visis, Downers Grove, IL, SUA). Pentru pacienții IV-1 și III-1, Sonda TelVysion 14Q (D14S1420, Spectrum Red) a fost utilizată pentru 14q32.33 și sonda TelVysion 15Q(D15S120, Spectrum Green) a fost utilizată pentru 15q26.3.
pentru a investiga prezența efectului interchromozomal, peștele cu trei culori a fost efectuat folosind al doilea amestec de sonde, care constă din sonde comerciale prin satelit (ADN) din Visis, inclusiv cromozomii 18, X și Y (CEP 18, Spectrum Blue/CEP X, Spectrum Green / Cep Y, Spectrum Red). Spălările Post-hibridizare au inclus 2 min în 0,4 xSSC/0,3% NP-40 (pH = 7) la 72 CTC, urmate de 1 min în 2XSSC / 0,1% NP-40 (pH = 7) la temperatura camerei. Diapozitivele au fost acoperite cu DAPI II (Visis). Au fost marcate doar spermatozoizii intacti care au un grad similar de decondensare și semnale clare de hibridizare. Toate spermatozoizii perturbați sau care se suprapun au fost excluși din analiză. Au fost analizate diapozitive cu eficiență de hibridizare de 99% și mai mult. Au fost analizate 1.000 de nuclee de spermă pe pacient.
hibridizarea genomică comparativă a matricei (aCGH)
hibridizarea genomică comparativă a matricei (aCGH) a fost introdusă în diagnosticul clinic pentru a detecta rapid câștigurile și pierderile la nivel genomic cu rezoluție mai mare . Este o metodă de transfer mare care detectează modificările numărului de copiere la o rezoluție de până la 1 Kb. Pentru analiza aCGH, ADN-ul a fost extras din sângele periferic . analiza aCGH s-a efectuat pe utilizarea celor 8 tablouri comerciale de 60 k (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA).
analiza datelor
analiza statistică a fost realizată cu ajutorul sistemului SAS (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC). Testul Chi-pătrat a fost utilizat pentru analiza segregării meiotice. O valoare de probabilitate mai mică de 0,05 (P < 0,05) a fost considerată semnificativă statistic.
rezultate
analiza cariotipului a fost efectuată pe patru membri ai familiei și a detectat două cariotipuri diferite de translocație Robertsoniană. Rezultatele sunt prezentate mai jos. III-1 și III-2 au fost heterozigoți, în timp ce IV-1 a fost homozigot.
-
III-1: 45,XY,der(14;15)(q10;q10)
-
III-2: 45,XX,der(14;15)(q10;q10)
-
IV-1: 44,XY,der(14;15)(q10;q10), der(14;15)(q10;q10)
-
IV-2: 46,XX
deoarece pacientul (IV-1) are un simptom de apatie, l-am trimis să vadă un psihiatru pentru o examinare aprofundată a stării mentale. Pacientul nu avea antecedente psihiatrice și a rămas cooperant în timpul interviului psihiatric. Procesele sale de gândire au fost liniare, logice și direcționate în mod constant, iar judecata sa a fost intactă. Prin urmare, nu s-au observat simptome psihice. În plus, consultarea neurologică nu a evidențiat deficite neurologice focale. Rezultatele tomografiei computerizate craniocerebrale (CT) și puncției lombare (LP) au fost normale. Electroencefalografia (EEG) nu a arătat semne de activitate convulsivă.
analiza aCGH pe IV-1 a detectat o duplicare de 2,03 Mb în regiunea q11.1-q11.2 pe cromozomul 15 (Fig. 3). Conform bazei de date de variație a numărului de copii (CNVdb), această duplicare este un polimorfism cromozomial în populația normală. Deoarece IV-1 este un purtător de translocație omolog Robertsonian și cei doi cromozomi derivați ai săi provin din același purtător de translocație Robertsonian, am speculat că fiecare dintre cei doi cromozomi derivați ar trebui să aibă o duplicare de 2,03 Mb în regiunea q11.1-q11.2 pe cromozomul 15.
analiza aCGH a IV-1 a evidențiat o duplicare de 2,03 Mb la cromozomul 15 q11.1-q11.2 (arr 15q11.1q11.2 (20.481.702-22.509.254) x4)
pentru a analiza spermatozoizii III-1 și IV-1, probele de spermă de la cei doi purtători de translocație Robertsonieni diferiți (III-1 și IV-1) au fost evaluate pentru volum, concentrație și motilitate conform criteriilor Organizației Mondiale a sănătății. Volumul, concentrația și mobilitatea spermei în III-1 sunt reduse semnificativ datorită vârstei înaintate. În schimb, toate sunt normale în IV-1 (Tabelul 1). Am analizat în continuare modelele de segregare meiotică în acești doi purtători de translocație Robertsonieni diferiți. În purtătorul de translocație Robertsonian heterozigot (III-1), Frecvența spermatozoizilor normali/echilibrați care rezultă din segregarea alternativă a fost de 79,9%, în timp ce frecvența spermatozoizilor dezechilibrați care rezultă din segregarea adiacentă a fost de 20,1%, ceea ce este semnificativ mai mare decât populația normală (Tabelul 2). În schimb, în translocația Robertsoniană homozigotă (IV-1), Frecvența spermatozoizilor echilibrați a fost de 99,7%, în timp ce frecvența spermatozoizilor dezechilibrați a fost de numai 0,3%, ceea ce este similar cu populațiile normale (Tabelul 2). Aceste date au demonstrat că aproape toți spermatozoizii homozigoților de translocație Robertsoniană au fost echilibrați, în timp ce cei ai heterozigoților au avut un procent de dezechilibrat. În plus, analiza cromozomială a spermei IV-1 a arătat fie un cariotip 22,X,der (14;15), fie un cariotip 22,Y, der(14;15) care susține speculațiile noastre. Așa cum se arată în Fig. 4, săgeata a indicat un spermatozoid cu patru semnale de fluorescență(două roșii și două verzi) sugerând că acest spermatozoid are doi cromozomi derivați ai der (14;15). Aceste date sugerează un mecanism potențial de speciație la om prin translocația Robertsoniană.
spermatozoizi după hibridizare cu TelVysion 14q32.33 (spectru roșu) și TelVysion 15q26.3 (spectru Verde). Sperma cu săgeată roșie poate fi un spermatozoid diploid
influența cromozomilor translocați asupra sinapselor și disjuncției altor cromozomi se numește efect interchromozomal (ICE) . Pentru a determina dacă gheața a fost prezentă, ratele de nulisomie, disomie și diploid pentru cromozomii 18, X și Y au fost analizate în ambii purtători de translocație Robertsoniană (Tabelul 3). În purtătorul de translocație Robertsonian heterozigot (III-1), a existat o creștere semnificativă a ratei aneuploidiei cromozomului sexual și a diploidului. În schimb, în translocația Robertsoniană homozigotă (IV-1), incidența spermatozoizilor cu nulisomie, disomie și diploid pentru cromozomii sexuali a rămas similară populațiilor normale (Tabelul 3) . Aceste date sugerează că ICE se prezintă numai la anumiți transportatori de translocație Robertsoniană.
discuție
purtătorii de translocație Rob sunt fenotipici normali, deoarece implică pierderi numai din material cu braț scurt. Sunt cunoscute multe astfel de rearanjări în populațiile naturale ale diferitelor specii. Rearanjările robertsoniene pot crește polimorfismele la o specie, pot oferi material pentru selecția naturală și chiar pot duce la speciație . S – a susținut că tipurile de rearanjamente cromozomiale care apar ca polimorfisme sau ca heterozigote permanente fixe implică invariabil cromozomi meta-sau submetacentrici. Cei care disting speciile și servesc la izolarea acestor specii implică cromozomi telocentrici sau acrocentrici, care se auto-sterilizează . În studiul nostru, IV-1, Care este un purtător de translocație omolog Robertsonian, a fost sănătos și a avut un complement cromozomial echilibrat. Evaluarea unei probe de material seminal din a arătat morfologia și motilitatea normală a spermei. Mai important, 99.7% din sperma sa este normală sau echilibrată (Tabelul 2) și nu a existat niciun efect interchromozomal (Tabelul 3).
peștele Multicolor pe nucleele spermei decondensate permite o analiză rapidă a segregării meiotice în sperma purtătorilor de translocație, oferind informații despre cantitatea exactă de spermă normală / echilibrată . Astfel de informații sunt, fără îndoială, importante nu numai pentru cercetarea citogenetică de bază, ci și pentru consilierea reproductivă a transportatorilor de translocație Robertsoniană. t (14;15) sunt translocații Robertsoniene rare. Datele noastre au confirmat studiile anterioare care arată că segregarea alternativă a fost mai frecvent decât segregările adiacente în purtătorii de translocații Robertsoniene . Cu toate acestea, modelele de segregare meiotică și efectele interchromozomale la doi purtători de translocație Robertsoniană sunt diferite (Tabelul 2). Aceste constatări sunt în concordanță cu datele publicate anterior . Prevalența ridicată a segregării alternative se datorează probabil cis-configurației trivalentului în timpul meiozei, ceea ce favorizează o segregare alternativă în toate translocațiile Robertsoniene . Deși un purtător de translocație Robertsonian are un complement genetic complet, capacitatea lor productivă este redusă datorită probabilității mari de gameți dezechilibrați genetic.
efectul interchromozomal ar putea fi explicat prin formarea de heterosinapse între cromozomii implicați în translocare și vezicula sexuală, care ar putea implica și alți cromozomi . Gheața rămâne controversată în literatură. Unele publicații au indicat prezența sa cu translocarea Robertsoniană, în timp ce altele nu au demonstrat nicio dovadă a acestui fenomen . În studiul nostru, am observat o incidență mai mare a aneuploidiei pentru cromozomii sexuali în spermatozoizi în translocația Robertsoniană heterozigotă, dar nu și în translocația Robertsoniană homozigotă, sugerând că gheața se prezintă doar la unii purtători de translocație Robertsoniană.
rearanjările Robertsoniene sunt modificări cromozomiale comune care pot duce la izolarea reproductivă rapidă și eficientă între populațiile cariotipice similare, mai ales atunci când mulți cromozomi Metacentrici Robertsonieni prezintă omologii monobrahiale . Translocațiile Robertsoniene homozigote au fost raportate de mai multe grupuri și revizuite sistemic de grupul O ‘ Neill . Dallapiccola și colab. a raportat un făt cu doi cromozomi t(14;21). Părinții înrudiți au fost heterozigoți pentru aceeași translocație. Martinez și colab. a raportat trei frați adulți homozigoți pentru t(13;14). Părinții lor erau veri primari și ambii erau purtători heterozigoți. Rajangam și colab. s-au găsit un unic cariotip DS 45, XY, der(14;21)pat, der(14;21)mat, +21mat. Deși heterozigozitatea translocării este asociată cu tulburări meiotice, ceea ce va duce la infertilitate și subfecunditate, nu ar trebui să aibă niciun efect asupra meiozei. Aici am raportat un bărbat cu un cariotip 44,XY,der(14;15)(q10;q10), der(14;15)(q10;q10). Translocarea robertsoniană poate oferi material pentru evoluție. Izolarea pe termen lung a unui grup de indivizi care sunt homozigoți pentru un anumit cromozom de translocație Robertsoniană ar putea duce teoretic la înființarea unei noi subspecii umane care să aibă un complement genetic complet în 44 de cromozomi. Deși diferențele cariotipice dintre specii au fost recunoscute de mult timp, întrebarea dacă aceste mutații joacă un rol cauzal în speciație rămâne fără răspuns . În studiul nostru, toți spermatozoizii homozigoților de translocație Robertsoniană au fost echilibrați, în timp ce cei ai heterozigoților au avut un procent de cei dezechilibrați implicând un potențial al homozigozității Translocațiilor Robertsoniene pentru speciație.