HPV/p16 pozitiv și negativ HNSCC prezintă diferențe în implicarea nodală
am determinat statusul HPV și p16 la 241 pacienți cu carcinom cu celule scuamoase orofaringiene (OPC) tratați cu (chemo)radiație (c)RT. Probele tumorale umane au fost achiziționate conform protocoalelor aprobate de Consiliul Etic al spitalelor universitare Leuven (Leuven, Belgia) și au fost obținute consimțământul implicit al tuturor pacienților. Datele clinicopatologice au fost extrase din diagramele pacienților, iar timpul mediu de urmărire a fost de 4,19 ani. Pacienții cu HPV pozitivi au fost caracterizați prin stadii t inferioare, 45% (26 din 58; p = 0,025) dintre pacienții cu HPV pozitivi prezentând tumori în stadiul T1/2, în timp ce aceasta a fost de 29% (51 din 175; p = 0,025) în grupul HPV negativ. Mai mult, tumorile HPV pozitive au arătat semnificativ mai mari (p = 0.014) implicarea nodală cu 72% (42 din 58) dintre pacienții cu HPV pozitivi care prezintă tumori N2/N3, în timp ce aceasta a fost de numai 54% (95 din 175) în grupul HPV negativ. Deși relația dintre starea p16 și stadiul N nu a fost semnificativă, s-a observat o tendință de implicare nodală mai mare și pozitivitate p16. Șaizeci și trei% dintre pacienții pozitivi p16 au prezentat tumori N2/N3, în timp ce aceasta a fost de numai 54% în grupul negativ p16 (Tabelul 1). Aceste rezultate sunt în concordanță cu alte studii, arătând că pacienții HNSCC cu HPV pozitiv au stadii N și t mai mari.
așa cum s-a anticipat, stadiile t scăzute au dus la rate mai bune de control la distanță (DC) cu rate de control la 5 ani de 83% și 70% (p = 0, 04) pentru T1/T2 și T3 / 4 tumori respectiv (fișier suplimentar 1: figura S1A). Tumorile N2/3 (5 ani DC 70%; p = 0,02) au prezentat un risc mai mare de eșec la distanță comparativ cu tumorile n0 / 1 (Rata de 5 ani DC 85%; p = 0,02) (fișier suplimentar 1: Figura S1B). Nu s-a observat nicio diferență semnificativă statistic în rata DC între boala HPV pozitivă și cea negativă (rata DC la 5 ani de 82% față de rata DC la 5 ani de 72%, respectiv; p = 0,20) (fișier suplimentar 1: Figura S1C). Deși nu este semnificativă, această diferență de 10% în ratele DC sugerează influența virusului dincolo de controlul local al tumorii. Mai mult, indică prezența diferitelor modele de diseminare între HPV hnscc pozitiv și negativ.
p16 reprimă capacitatea de invazie și migrare a HNSCC HPV pozitiv
pentru a investiga mecanismul molecular din spatele acestor diferențe potențiale observate în metastaze în cohorta noastră de pacienți, am evaluat capacitatea de migrare și invazie in vitro a celulelor HNSCC. Celulele HPV / p16 pozitive SCC154 și SCC104 au prezentat o rată de migrare semnificativ mai mică comparativ cu celulele HPV/P16 negative SQD9, CAL27 și SC263 (Fig. 1a). În acord cu testul de migrare, celulele pozitive HPV/p16 au prezentat abilități de invazie reduse comparativ cu celulele negative HPV/p16 (Fig. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). D capacitatea de invazie a celulelor SCC154 HPV pozitive tratate cu shRNA pentru p16 (shp16) și control (shluc). (a-d) rezultatul este prezentat ca medie sem-uri de la trei experimente, iar valorile p sunt calculate prin testul t pe două fețe
supresorul tumoral p16 este un regulator bine cunoscut al ciclului celular și un bun marker surogat pentru HPV hnscc pozitiv . Mai mult, datele recente atribuie un rol mai larg pentru p16, inclusiv un rol în migrație și reprimarea angiogenezei . Prin urmare, am examinat și influența p16 asupra capacității de migrare și invazie a celulelor SCC154 HPV pozitive manipulate cu ARN cu ac de păr scurt (shRNA) pentru p16 (shp16) și shRNA de control (shluc). Reglarea descendentă a expresiei p16 a crescut capacitățile de migrare și invazie ale celulelor SCC154 (Fig. 1c și d). Aceste date verifică prezența diferențelor în modelele de diseminare între HPV hnscc pozitiv și negativ și sugerează un rol activ al p16 în cascada metastatică.
p16 suprimă migrația și invazia prin angiogeneză în HPV hnscc pozitiv
este bine cunoscut faptul că angiogeneza, care este susținută activ în celulele canceroase de factori Pro-angiogeni, cum ar fi factorul de creștere endotelial vascular a (VEGFA), este o conductă pentru răspândirea celulelor canceroase și metastaze și promovează progresia agresivă a tumorii . Mai mult, corelația negativă dintre HPV/p16 și VEGFA este descrisă anterior în HNSCC . Prin urmare, am evaluat relația dintre HPV, p16 și VEGFA în cohorta noastră de pacienți. Pacienții cu HPV pozitivi au prezentat o expresie VEGFA semnificativ mai scăzută, cu 54% (28 din 51) dintre pacienți care nu au prezentat sau au prezentat o expresie VEGFA scăzută, comparativ cu 32% (53 din 161) în grupul HPV negativ (Tabelul 2). Deși corelația negativă dintre VEGFA și p16 a fost mai puțin pronunțată, s-a observat o tendință de semnificație (Tabelul 2).
am investigat în continuare relația dintre angiogeneză și p16 cu xenogrefe in vivo injectate cu celule HPV pozitive SCC154 manipulate cu shp16 sau shluc. Un număr mai mare de vase de sânge a fost detectat la tumorile de șoareci cu expresie P16 scăzută comparativ cu tumorile de control (Fig. 2a). În plus, creșterea vascularizării a dus la necroză mai mică, număr mai mare de celule mitotice și avantaj de creștere a tumorilor care exprimă shp16 (fișier suplimentar 2: Figura S2A-C). Nu am putut verifica implicarea p16 în suprimarea metastazelor in vivo din cauza absenței unui model animal metastatic. Cu toate acestea, avantajul de creștere și vascularizarea crescută observată la tumorile șoarecilor shp16 pot explica apariția frecventă a stadiilor t avansate la pacienții cu HNSCC negativ HPV.
rolul dublu al p16 în diseminarea HNSCC. o formare a vaselor de sânge în modelele de șoarece xenogrefă scc154 shp16 și SCC154 shluc evaluate prin colorarea CD31 (deasupra graficului); n = 5. b Numărul mediu de formare a vaselor limfatice în modelele de șoarece xenogrefă scc154 shp16 și SCC154 shluc evaluate prin colorarea LYVE-1 (deasupra graficului); n = 5. c scorul mediu al colorării integrinei alpha4 beta1 la modelele xenogrefă de șoarece SCC154 shp16 și SCC154 shluc; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. valorile A-d P sunt calculate prin testul t pe două fețe
P16 stimulează limfangiogeneza și răspândirea nodală la HPV HNSCC pozitiv
aceste rezultate încă nu explică apariția unor rate similare de recidivă la distanță la pacienții cu HPV/p16 cu HNSCC pozitiv și negativ și cu siguranță nu explică asocierea pozitivitatea și implicarea nodală descrise în studiile noastre și în alte câteva studii . Acest lucru este deosebit de important deoarece implică prezența unui potențial metastatic local ridicat în HNSCC HPV pozitiv. Interesant limfangiogeneza, cum ar fi angiogeneza, promovează metastazele tumorale prin inducerea creșterii de noi vase limfatice în cadrul tumorii și prin creșterea traficului de celule către ganglionii limfatici. Mai mult, creșterea densității vaselor limfatice în tumori este asociată cu creșterea metastazelor la ganglionii limfatici. . Prin urmare, am evaluat formarea vaselor limfatice prin imunostimularea hialuronanului vasului limfatic omolog (LYVE-1) în tumorile șoarecilor shluc și shp16. Am constatat că supresia p16 a dus la scăderea densității vaselor limfatice în xenogrefele pozitive HPV/p16 sugerând un rol dublu al p16 în metastaze (Fig. 2b).pentru a înțelege funcția p16, ne-am concentrat pe integrine, deoarece aceste proteine sunt acceptate ca regulatori cheie ai angiogenezei și limfangiogenezei . Mai mult, legarea p16 de integrine și pierderea răspândirii celulare este documentată anterior . Integrinele precum alpha4 beta1 sunt modulatori importanți ai limfangiogenezei . Prin urmare, am evaluat prezența integrinei alpha4 beta1 în tumorile șoarecilor SCC154 shluc și SCC154 shp16. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).