figura 7.2. Funcția Rat1 în mecanismul torpilă de terminare a transcrierii. (A) Transcrierea ARNm pol II în curs de formare este scindată cotranscripțional de componenta Ysh1 a factorului de specificitate de clivaj și poliadenilare (CPSF). Capătul 5 ‘ monofosforilat expus rezultat al ARN-ului din aval este un substrat pentru degradarea rapidă de către Rat1/Rai1, care a fost recrutat în complexul Pol II prin intermediul proteinelor Pcf11 și Rtt103 care interacționează cu CTD ser2-fosforilat. Complexul de alungire este destabilizat după ce Rat1 / Rai1 ajunge din urmă cu polimeraza. Terminarea dependentă de Rat1 este stimulată de Helicaza Sen1 care interacționează cu subunitatea Rpb1 large Pol II și facilitează recrutarea Rat1. (B) pre-ARNr nou sintetizat este scindat cotranscripțional de către endonucleaza Rnt1 și produsul 3’ rezultat este degradat de Rat1/Rai1, care torpilează Pol I. terminarea eficientă Pol i necesită, de asemenea, legarea Nsi1 și/sau Reb1 la terminatorul T1 (caseta verde), provocând întreruperea polimerazei, subunitatea specifică Pol i Rpa12 și helicaza Sen1, care se asociază cu ADNR și interacționează direct cu Rnt1. (A se vedea secțiunea placă de culoare în partea din spate a cărții.) Terminația eficientă Pol i necesită, de asemenea, legarea Nsi1 și/sau Reb1 la terminatorul T1 (caseta verde), provocând întreruperea polimerazei, subunitatea specifică Pol i Rpa12 și helicaza Sen1, care se asociază cu ADNR și interacționează direct cu Rnt1.

lucrările ulterioare au arătat că Rat1 în drojdie și Xrn2 la om au fost responsabile pentru activitatea torpilei și că lipsa oricăreia dintre enzime, precum și a activatorului Rat1 Rai1 în drojdie, duce la un defect de terminare, care se manifestă ca o citire extensivă a transcrierii. De asemenea, este posibil ca un omolog al plantei Rat1, Arabidopsis AtXRN3, să acționeze ca un factor de terminare a transcripției similar cu Rat1/Xrn2. Abordările cu randament ridicat au relevat o acumulare de transcrieri necodificatoare de la capătul 3’al ARNm și microARN (miARN) gene în mutantul de eliminare xrn3, care poate corespunde moleculelor de citire transcripțională . Astfel, AtXRN3 poate participa la o supraveghere globală a ARN 3 ‘ ca urmare a activității sale de terminare a torpilelor.

mecanismul torpilei depinde de activitatea catalitică a exonucleazei Rat1 și nu doar de prezența acesteia . Substratul ARN monofosforilat pentru Rat1 / Xrn2 în timpul sintezei ARNm este generat ca urmare a unei scindări cotranscripționale (CoTC) la locul poliadenilării de către mecanismul de formare a capătului ARNm 3′. Mai precis, acest proces este realizat de componenta YSH1 a CF II în drojdie sau subunitatea CPSF-73 corespunzătoare a factorului de clivaj uman și specificitate de poliadenilare (CPSF) (revizuit în Ref. ). Doi factori au fost propuși pentru a contribui la rezilierea eficientă: rezistența semnalului Poli (a) și acțiunea exonucleazei care degradează produsul de clivaj 5′, care facilitează întreruperea polimerazei în aval de situl Poli(a) și promovează eliberarea acesteia . Pe de altă parte, încetarea dependentă de rat1 afectată nu elimină recunoașterea adecvată a sitului Poli(A) și scindarea ARNm .

pot apărea locuri suplimentare de intrare Rat1 / Xrn2 prin CoTC autocatalitic în aval de situl Poli(a) la mamifere sau clivaj endonucleolitic de Rnt1 în drojdie . Ultimul caz a fost raportat ca un mecanism de terminare în siguranță pentru genele care codifică proteinele, care, împreună cu calea mediată de complexul Nrd1/Nab3/Sen1 (NRD), oferă un mod de rezervă pentru eliberarea Pol II.

deși Rat1 / Xrn2 este necesar pentru întreruperea eficientă a Pol II, Rat1 nu reușește să declanșeze întreruperea in vitro și activitatea sa de degradare 5′-3′ nu este suficientă pentru a promova disocierea polimerazei in vivo. În mod consecvent, drojdia xrn1 orientată către nucleu este capabilă de degradarea cotranscripțională a ARN-ului în curs de formare, dar nu salvează defectele de terminare cauzate de o deficiență Rat1. Aceste observații sugerează că exonucleaza prinderea cu polimeraza este necesară, dar nu suficientă pentru a destabiliza complexul de alungire și că un element suplimentar al mecanismului torpilei funcționează în timpul terminării. S-a postulat că o caracteristică unică Rat1, domeniul turn extins, care nu este prezent în proteinele Xrn1, poate fi responsabil pentru proprietățile sale de terminare . Este posibil ca domeniul turnului să sufere anumite modificări sau să servească drept interfață pentru interacțiunile cu factorii de îmbunătățire a terminării. Unul dintre posibilii candidați pentru factorii care stimulează terminarea dependentă de Rat1 este ARN helicaza Sen1, care este o componentă cheie a căii de terminare pentru ARN-urile necodificate din drojdie (vezi mai jos) care contribuie, de asemenea, la încetarea genelor care codifică proteinele, cu cel mai puternic efect asupra ARNm mai scurte . Sen1 interacționează prin domeniul său N-terminal cu cea mai mare subunitate Pol II, Rpb1 și afectarea activității helicazei Sen1 afectează distribuția Pol II la nivel de genom peste genele de codificare și necodificare . Omologul Sen1 uman, Senataxin, s-a dovedit că promovează direct terminarea transcripției mediată de Xrn2 prin rezolvarea hibrizilor ARN:ADN (bucle R) formate în spatele pol ii alungitor, predominant la locurile de pauză bogate în G în aval de situl Poli(a). Această activitate facilitează accesul Xrn2 la produsele de clivaj Poli(a) site 3′ și contribuie astfel la recrutarea exonucleazei torpilei. Modul de acțiune al drojdiei Sen1 este considerat a fi similar .

o întrebare fără răspuns este modul în care Rat1 este recrutat la polimeraza alungitoare. Mai multe observații susțin asocierea Rat1 prin intermediul proteinelor care interacționează cu domeniul Pol II C-terminal (CTD) prin domeniul lor de interacțiune CTD (CID), și anume subunitatea Pcf11 a factorului de clivaj al drojdiei IA (CFIA) și Rtt103 (regulator al transpunerii Ty1 103). Rat1 și Rai1 sunt prezente la promotorii și regiunile de codificare cu o îmbogățire puternică la capetele 3 ‘ ale genelor. S-a demonstrat că interacțiunea funcțională dintre Rat1 și Pcf11 facilitează corecrutarea reciprocă a ambilor factori: Rat1 leagă terminarea la formarea 3′-end prin stimularea recrutării factorilor de procesare 3’ – end, în special subunitățile CFIA Pcf11 și Rna15, în timp ce Pcf11 contribuie la asocierea Rat1 pe site-ul Poli(a). De asemenea, s-a demonstrat că Pcf11 uman îmbunătățește degradarea ARN-ului în curs de formare și promovează terminarea transcripției . La rândul său, Rtt103, care se asociază și în apropierea capetelor 3’ale genelor, copurifică cu Rat1, Rai1 și Pcf11 și, împreună cu Pcf11, recunoaște în mod cooperativ CTD ser2-fosforilat al pol ii alungitor . Pe de altă parte, distribuția Rat1 asupra genelor nu este modificată în absența Rtt103 . În plus , Rat1 termină și transcrierea prin Pol I, care nu are un CTD, sugerând că recrutarea Rat1 poate avea loc și prin alte mecanisme. Într-adevăr, asocierea hXrn2 a fost raportată a fi mediată de p54nrb/PFS (factorul de îmbinare asociat proteinelor), care sunt proteine multifuncționale implicate în transcriere, îmbinare și poliadenilare . Rolul p54nrb / PFS în terminarea transcrierii Pol II a fost demonstrat și în C. elegans.în plus față de ARNm, Pol II sintetizează o gamă largă de transcrieri necodificate, inclusiv ARN-uri nucleare mici și snoRNAs și o varietate de ARN-uri instabile. În drojdie, transcrierea acestor specii relativ scurte este încheiată în principal de un complex alternativ NRD, compus din proteinele care leagă ARN Nrd1 și Nab3 și helicaza dependentă de ATP Sen1 . Deoarece acest mecanism cel mai probabil nu implică o clivaj endonucleolitic cotranscripțional , este ARN Sen1:activitate de derulare hibridă a ADN-ului care se crede că este esențială pentru disocierea polimerazei, poate într–un mod similar cu bacterian Rho ADN-ARN helicază. Rho destabilizează probabil complexul de alungire prin translocarea de-a lungul și îndepărtarea ARN-ului născut din polimerază . Un model alternativ, alosteric, susține că Rho se încarcă pe polimerază și induce rearanjări în situsul activ al enzimei la locurile de terminare . Ambele moduri de acțiune se pot aplica pentru Sen1 helicase.

deși Rat1 este recrutat la genele snoRNA, în special la cele intronice, încetarea dependentă de NRD a transcrierilor snoRNA nu este afectată atunci când lipsește și, prin urmare, s-a sugerat că participă la unele evenimente de terminare prematură . Cu toate acestea, este încă posibil ca mecanismul torpilei Rat1 să contribuie la terminarea transcrierii snoRNAs, cum ar fi U3 sau snR40, al cărui capăt 3’este eliberat de clivajul Rnt1 care expune restul transcrierii 5′-end pentru atacul Rat1 .în mod surprinzător, s-a demonstrat că Rat1 se colocalizează cu Pcf11 la telomeri și la Arnt transcris Pol III, ARNr 5s și genele SCR1 . Semnificația funcțională a acestor observații este în prezent neclară, dar modurile alternative de terminare a acestor ARN-uri și degradarea transcrierilor aberante sau prelucrarea ARN-urilor necodificate instabile, cum ar fi Terra telomerică, sunt o posibilitate (tabelul 7.1).