bacteriofagii, numiți și fagi, sunt viruși care infectează în mod specific bacteriile și le putem confirma prezența și cuantifica folosind un instrument numit testul plăcii. Bacteriofagii își infectează gazdele sensibile atașându-se mai întâi de peretele celular bacterian și injectându-și materialul genetic. Apoi, ei deturnează mecanismul biosintetic al celulei pentru a-și reproduce ADN-ul și a produce numeroase particule de fag descendenți, pe care apoi le eliberează prin lizarea și uciderea celulei gazdă.

această activitate litică este baza unei tehnici de enumerare a fagilor utilizate pe scară largă, cunoscută sub numele de testul plăcii sau testul stratului dublu de agar. Aici, un amestec de bacteriofag este preparat mai întâi într-un bulion de nutrienți topiți care conține agar cu concentrație scăzută. Toate bacteriile utilizate în amestec ar trebui să fie vii și să se împartă activ în faza de jurnal a creșterii lor, ceea ce va asigura că un procent mare de bacterii sunt viabile și capabile să formeze o peluză densă în jurul plăcilor. Apoi, acest amestec de agar bacterian-fag topit este răspândit pe un mediu nutritiv mai solid, concentrat de agar, care este deja solidificat pe un vas Petri. La incubare la temperatura camerei, bulionul de agar-fag-bacterii cu concentrație scăzută se solidifică, de asemenea, pentru a forma o suprapunere moale de agar.aici, celulele bacteriene pot obține nutrienți suplimentari din stratul inferior și ar trebui să se înmulțească rapid pentru a produce o peluză confluentă de bacterii. Cu toate acestea, deoarece particulele de fag sunt prezente și în stratul moale, acestea vor infecta și Replica materialul lor genetic în interiorul bacteriilor, culminând cu liza celulară, care eliberează descendenți multipli. Acești descendenți ai fagilor infectează apoi celulele vecine, deoarece starea semi-solidă a stratului bacterian-fag limitează mișcarea lor la celule gazdă mai îndepărtate. Acest ciclu de infecție și liză continuă pe mai multe runde, ucigând un număr mare de bacterii într-o zonă localizată. Efectul celulelor vecine fiind distruse, este de a produce o singură zonă circulară clară, numită placă, care poate fi văzută cu ochiul liber, amplificând în mod eficient activitatea litică a bacteriilor fagului și permițând enumerarea lor.

Numărul de plăci de pe un vas Petri sunt denumite unități formatoare de plăci sau PFU și, cu condiția ca concentrația inițială de bacteriofag să fie suficient de diluată, ar trebui să corespundă direct numărului de particule de fag infecțios din proba inițială. Această tehnică poate fi utilizată și pentru caracterizarea morfologiei plăcii, pentru a ajuta la identificarea tipurilor de fagi sau pentru a izola mutanții fagi. În acest laborator, veți învăța cum să efectuați testul plăcii pentru enumerarea fagilor, folosind fagul T7 al E. coli ca exemplu.în primul rând, identificați un mediu adecvat pentru cultivarea celulelor bacteriene gazdă și a bacteriofagului. Aici bulionul de lizogenie, sau mediul LB, a fost folosit pentru cultura E. coli și fagul T7. Apoi, luați trei sticle de sticlă curate și etichetați-le cu suporturi, nume, apoi primul ca bulion LB, al doilea ca Agar de jos LB și al treilea ca Agar de sus LB. Acum, cântărește patru grame de pulbere LB pre-formulată în trei seturi și apoi transferă un set de medii uscate cântărite în fiecare sticlă. Adăugați 200 mililitri de apă în prima sticlă. Se amestecă conținutul folosind o bară magnetică de agitare.

apoi, folosind un pH-metru și agitare constantă, aduceți pH-ul final la 7,4 prin adăugarea de hidroxid de sodiu sau acid clorhidric. Repetați adăugarea de apă și ajustarea pH-ului și pentru celelalte două sticle rămase. Acum, cântăriți trei grame de pulbere de agar și adăugați-o în a doua sticlă pentru a face un agar de fund de 1,5%. În cele din urmă, cântăriți 1. 2 grame de agar și adăugați-l la a treia sticlă pentru a face .6% LB top agar. Starea bulionului din sticlă nu are nevoie de adaos de agar. Acoperiți sticla semi-strâns și apoi sterilizați mediul prin autoclavare la 121 grade Celsius timp de 20 de minute. După finalizare, scoateți sticlele media din autoclavă și răsuciți imediat capacele flaconului pentru a le închide complet pentru a preveni contaminarea. Păstrați suportul de agar LB-bulion și lb-Top pe bancă pentru o utilizare ulterioară. Așezați agarul cu fundul LB pentru a se răci într-o baie de apă presetată la aproximativ 45 de grade Celsius.

când agarul inferior LB atinge aproximativ 45 de grade Celsius, transferați-l pe banca de lucru. Apoi, sterilizați spațiul de lucru folosind 70% etenol. Apoi, adăugați 450 microlitri de clorură de calciu molară sterilă la agarul de fund topit pentru a obține o concentrație finală de 2.25 milimolari. Rotiți ușor sticla pentru a se amesteca. Apoi, a stabilit șapte vase Petri curate. Etichetați fiecare fel de mâncare în partea de jos cu numele suportului și data pregătirii. Apoi, turnați 15 mililitri de agar de fund În fiecare dintre cele șapte vase Petri. Lăsați plăcile să se stabilească câteva ore sau peste noapte la temperatura camerei. Odată setate, plăcile de cultură pot fi păstrate la patru grade Celsius timp de câteva zile, dacă este necesar, cu susul în jos pentru a minimiza condensul. Transferați vasele Petri din frigiderul cu patru grade Celsius într-un incubator de 37 de grade Celsius cu o oră înainte de testare.

cu o zi înainte ca testul să fie preformat, E. coli trebuie cultivat. Aici, 10 microlitri de cultură E. coli au fost inoculați în 10 mililitri de bulion LB. Așezați bacteriile pentru a crește peste noapte într-un incubator agitat setat la 37 de grade Celsius la 160 RPM. Apoi, în ziua testului, scoateți cultura bacteriană din incubator. Se însămânțează un proaspăt 10 mililitri de bulion proaspăt LB cu 0,5 mililitri de cultură peste noapte. Așezați aceste celule pentru a crește într-un incubator agitat setat la 37 de grade Celsius la 160 RPM. Apoi, utilizați un spectrofotometru pentru a verifica când această cultură atinge creșterea fazei log, indicată de o densitate optică de 0,5 până la 0,7. Odată ce OD atinge acest nivel, opriți incubarea transferând cultura celulară pe bancă. Acum sunt gata să fie utilizate pentru testul de suprapunere a fagilor.

titrurile de fagi pot varia exponențial între diferite tipuri și probe de fagi. Deci, pentru a le număra eficient, acestea ar trebui diluate pentru a genera o gamă largă de concentrații de fag. În ziua testului, generați o serie de diluții de fag variind de la o zecime la o milionime de concentrații, urmând o tehnică de diluare de 10 ori. Pentru a obține date semnificative statistic și exacte, efectuați diluția în serie în trei exemplare.

apoi, topiți agarul solidificat LB-top folosind un cuptor cu microunde. Apoi, așezați-l într-o baie de apă care este presetată la 45 de grade Celsius timp de o oră. După o oră, colectați vasele Petri care conțin stratul de agar inferior din incubator. Etichetați plăcile cu concentrația fagului și data testului. Apoi, setați șapte eprubete curate. Etichetați fiecare eprubetă cu numărul serial de diluare a fagului și desemnați unul ca martor.

când agarul LB-top atinge 45 de grade Celsius, transferați-l pe banca de lucru. Acum, adăugați 450 microlitri dintr-o clorură de calciu molară la agarul de 200 mililitri pentru a obține o concentrație finală de 2,25 milimolari. Rotiți ușor sticla pentru a se amesteca. Apoi, adăugați 35 mililitri de agar LB-top și patru mililitri de suspensie bacteriană într-un tub conic steril. Rotiți ușor pentru a distribui uniform celulele, dar evitați agitarea pentru a preveni spumarea.

acum, alicotați cinci mililitri din acest amestec de agar bacterian – top la fiecare dintre cele șapte eprubete. Apoi, transferați 100 microlitri din probele de bacteriofag diluat în serie și mediile de control, care ar trebui să fie pur și simplu medii fără bacteriofag, în eprubetele etichetate respectuos. Rotiți ușor amestecul pentru a asigura o amestecare adecvată. Transferați ușor cinci mililitri de amestec de bacteriofag pe placa Petri respectivă. Răspândiți uniform amestecul pe întreaga suprafață prin rotirea ușoară a plăcii Petri.

odată ce toate plăcile Petri sunt stratificate cu amestecul, permiteți solidificarea stratului superior prin incubare la temperatura camerei timp de 15 minute. După finalizarea acestor pași, repetați procesul pentru al doilea și apoi al treilea set de vase Petri folosind celelalte două seturi de diluții de fagi. Sigilați fiecare vas cu parafilm și incubați la temperatura camerei timp de 15 minute. Așezați placa de cultură cu capul în jos la o temperatură adecvată timp de 24 de ore sau până când se dezvoltă plăcile. Aici, plăcile au fost plasate într-un incubator de 37 de grade Celsius pentru o zi, o condiție de creștere stimulantă pentru E. coli și fagul T7.

plăcile vor apărea după una până la cinci zile de incubație, în funcție de speciile bacteriene, condițiile de incubație și alegerea mediului. Aici, plăcile au fost vizibile după o zi de incubație la 37 de grade Celsius. Începeți prin verificarea plăcilor marcate control și asigurați-vă că nu s-au format plăci în aceste plăci, deoarece acest lucru ar indica contaminarea virală. Pentru a determina titrul de fagi din proba originală, începeți mai întâi cu plăcile care conțin cea mai diluată probă de fagi și numărați plăcile fără a îndepărta capacele, marcându-le pentru a indica care au fost deja numărate. Repetați numărarea pentru fiecare placă din fiecare set. Unele plăci ar putea avea prea multe sau prea puține plăci pentru a fi numărate. Luați în considerare 10 până la 150 ca număr ideal de plăci.

apoi, generați un tabel cu valorile numărului plăcii pentru diferitele diluții și replici. Apoi, calculați valorile medii ale numărului plăcii pentru plăcile de diluare care conțineau numărul ideal de plăci. În acest exemplu, acestea au fost numărul mediu de plăci formate în 10 până la minus trei și 10 până la minus patru plăci de diluare. Acum, ajustați factorul de diluare a fagului prin împărțirea valorilor medii ale plăcii obținute la factorii de diluare a fagului respectivi. Aici, numărul mediu de plăci formate la 10 la minus trei și 10 la minus patru plăci de diluare, au fost împărțite la factorii lor de diluare respectivi pentru a obține numărul de unități care formează plăci sau PFU, în 100 microlitri de amestec de fag. Pentru a converti valoarea în PFU pe mililitru, înmulțiți valorile generate cu 10, deoarece numai 100 microlitri de amestec de diluare a fagului au fost utilizați în timpul etapei de preparare a suprapunerii bacteriofagului, producând un factor de diluare suplimentar de 10. În cele din urmă, calculați media valorilor obținute din diferitele plăci de diluare. Acest lucru va da numărul mediu de PFU pe mililitru. Numărul de PFU corespunde numărului de particule de fagi infecțioși din proba originală.