Michelle Dotzert, PhD
vad är skillnaden mellan en Södra, norra och västra Blot?
olika blottingtekniker används för att identifiera unika proteiner och nukleinsyrasekvenser. Södra, norra och västra blotprotokoll är likartade och börjar med elektroforetisk separation av protein-och nukleinsyrafragment på en gel, som sedan överförs till ett membran (nitrocellulosamembran, polyvinylidendifluorid (PVDF) membran etc.) där de är immobiliserade. Detta möjliggör radiomärkt eller enzymatiskt märkt antikropp eller DNA-prober för att binda det immobiliserade målet, och molekylerna av intresse kan sedan visualiseras med olika metoder. Blotting tekniker väljs baserat på målmolekylen: DNA, RNA eller protein. (Figur 1, Tabell 1).
Southern Blot
Southern blots används för att bestämma identitet, storlek och överflöd av specifika DNA-sekvenser. Southern blot-protokollet börjar med DNA-extraktion från cellerna eller vävnaderna, som sedan enzymatiskt smälts för att producera DNA-fragment. Fragmenten separeras med storlek på en agaros-eller polyakrylamidgel via elektrofores. Mindre fragment kommer att migrera längre på gelen än större. Efter elektrofores överförs DNA på gelen till ett nylonmembran. Membranet inkuberas med en nukleinsyrasond som har en sekvens som är homolog med målsekvensen och är märkt med radioaktivitet, fluorescerande färgämne eller ett enzym som kan generera en kemiluminescerande signal. Hybridisering av komplementära sekvenser sker under inkubation, och den ohybridiserade sonden avlägsnas genom tvättning med buffert. De fullständigt hybridiserade märkta sondmolekylerna kommer att förbli bundna till blot. Detekteringsmetoderna skiljer sig åt baserat på sondetiketten; radiomärkta sonder visualiseras med röntgenfilm eller fosforimaging, och enzymatiskt märkta sonder visualiseras med kemiluminescerande substrat.
Southern blot protocol
- DNA-isolering
- Restriktionsförtunning: smälta DNA med ett restriktionsenzym och koncentrera vid behov digererat DNA.
- gelelektrofores: förbered en agarosgel och antingen tae-eller TBE-buffert (buffertval beror på körningens varaktighet och storleken på DNA-fragmenten). Ladda prover i brunnar och inkludera en DNA-molekylviktmarkör. Kör gelen.
- Transfer:
- placera gelen i en behållare med denatureringslösning och tvätta två gånger i 15 minuter på en shaker.
- skölj med vatten och tvätta sedan med neutraliseringslösning.
- under föregående steg börjar du förbereda Whatman-papper och nylonmembran för överföringen.
- montera överföringsapparaten med membranet, Whatman-papperet och gel och överföring i SSC-eller SSPE-buffert.
- när överföringen är klar, tvärbind DNA i en tvärbindare, skölj sedan membranet.
- Pre-hybridisering (blockering):
- blockering minskar icke-specifik bindning till membranet. Förbered pre-hybridiseringslösningen och tillsätt prov-DNA. Ta bort fläcken från tvärlänkaren, tillsätt Pre-hybridiseringslösningen och inkubera.
- hybridisering:
- Förbered sondblandningen (en komplementär DNA-sträng) och buffert.
- ta bort Pre-hybridiseringslösningen och inkubera fläcken med sonden (inkubationstiderna varierar beroende på applikationen).
- efter inkubation, utför en tvätt med låg stringens följt av en tvätt med hög stringens för att förfina DNA.
- Sonddetektering:
- skölj membranet, överför det till en behållare med blockeringslösning och inkubera.
- kassera blockeringslösning, ersätt med antikroppslösning och inkubera.
- kassera antikroppslösning, tvätta membranet.
- Följ tillverkarens anvisningar för kemiluminescerande detektering.
Northern Blot
Northern blots används för att bestämma identitet, storlek och överflöd av specifika RNA-sekvenser. Northern blot-protokoll börjar med RNA-isolering, och separationstekniker varierar beroende på RNA-storlek. Stora rna separeras genom elektrofores på en formaldehydagarosgel eller glyoxal agarosgel, vilket förhindrar normal basparing och upprätthåller RNA i ett denaturerat tillstånd. Små RNA separeras på en denaturerande (urea) polyakrylamidgel. RNA överförs sedan från gelen till ett nylonmembran som sedan inkuberas med en radioaktivt eller nonisotopiskt märkt RNA -, DNA-eller oligodeoxynukleotidsond. Den ohybridiserade sonden avlägsnas genom tvättning med buffert. Radiomärkta sonder visualiseras med röntgenfilm och enzymatiskt märkta sonder visualiseras med kemiluminescens.
Northern blot protocol
- RNA isolation
- elektrofores:
- för en formaldehydagarosgel: Förbered gelen och sätt in gelbrickan i apparaten. Fyll med MOPS buffert, ladda proverna och inkludera en molekylvikt markör. Kör gelen och trimma sedan gelen före blotting.
- för en glyoxal agarosgel: Förbered gelen och sätt in gelbrickan i apparaten. Fyll med MOPS buffert, förbereda prover och ladda i brunnar tillsammans med RNA stege.
- för en denaturerande polyakrylamidgel: gjut gelen och montera den i elektroforesenheten. Förbered prover, ladda in i gelen och kör med TBE-körbuffert.
- Transfer:
- för en formaldehydagarosgel eller glyoxal agarosgel: tvätta gelen i SSC och montera sedan överföringsenheten med gel, filterpapper och nylonmembran. När överföringen är klar, placera membranet i en UV-tvärbindare.
- för en denaturerande polyakrylamidgel: montera överföringsenheten inklusive gel, filterpapper och nylonmembran så att de översvämmas med TBE. När överföringen är klar, placera membranet i en UV-tvärbindare för att fixera RNA till membranet.
- Pre-hybridisering (blockering):
- Pre-hybridisera membranet i hybridiseringslösning.
- hybridisering:
- Lägg till sond i hybridiseringslösningen och inkubera.
- tvätta membranet i tvättar med låg stringens för att avlägsna hybridiseringslösning och ohybridiserad sond, och tvättar med hög stringens för att avlägsna delvis hybridiserade molekyler.
- Följ tillverkarens anvisningar för kemiluminescerande detektering.
Western Blot
Western blots används för att bestämma identiteten, storleken och överflödet av specifika proteiner i ett prov. Western blot-protokollet börjar med provlysatberedning från vävnad eller cellodling och separation på en polyakrylamidgel via elektrofores. De separerade proteinerna överförs sedan till ett nitrocellulosa-eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Membranet inkuberas med ett blockeringsmedel för att förhindra icke-specifik bindning, följt av inkubation med en primär antikropp för att binda proteinet av intresse. Det finns två detekteringsmetoder, direkt och indirekt. Direkt detektion (Figur 2) är beroende av en märkt primär antikropp, medan indirekt detektion kräver en primär antikropp riktad mot målproteinet och en sekundär antikropp riktad mot immunoglobinklassen eller underklassen hos den primära antikroppens Art (Figur 3). Visualiseringsmetoder inkluderar kolorimetriska analyser där en färgad fällning produceras, kemiluminescens och fluorescens.
Western blot protocol
- Förbered lysat från cellodling eller vävnad.
- provberedning:
- Bestäm proteinkoncentrationen för varje prov med en proteinkvantifieringsanalys (dvs. Bradford-analys).
- Lägg till en lika stor volym av 2x laemmli provbuffert till varje prov.
- vissa prover kan behöva minskas eller denatureras, detta uppnås genom att koka prover i buffert.
- elektrofores:
- Förbered en SDS-PAGE gel, ladda prover tillsammans med molekylvikt markör.
- kör gelen i löpande buffert.
- Transfer:
- efter elektrofores, montera överföringsenheten inklusive gel -, PVDF-eller nitrocellulosamembranet och filterpapper.
- överför proteinerna till membranet med överföringsbuffert.
- Antikroppsfärgning (indirekt detektion):
- Förbered blockeringsbuffert och inkubera membranet för att minska icke-specifik bindning.
- inkubera membranet med primär antikropp utspädd i blockerande buffert.
- tvätta membranet i TBST och inkubera med konjugerad sekundär antikropp utspädd i blockerande buffert.
- tvätta membranet i TBST.
- Följ tillverkarens anvisningar för kemiluminescerande detektering.