4.2.1 Polimerasa II

Aunque la terminación de la transcripción ha sido mucho menos explorada que su iniciación, los últimos 25 años han revelado que la liberación oportuna y precisa de la transcripción naciente y de las polimerasas de ARN de la plantilla de ADN es crucial para el destino del ARN, así como para el mantenimiento general del genoma.

Un trabajo posterior reveló que Rat1 en levadura y Xrn2 en humanos fueron responsables de la actividad del torpedo y que la falta de cualquiera de las enzimas, así como el activador de Rat1 Rai1 en levadura, conduce a un defecto de terminación, que se manifiesta como una lectura de transcripción extensa. También es posible que un homólogo de planta Rat1, Arabidopsis AtXRN3, actúe como factor de terminación de transcripción de manera similar a Rat1/Xrn2. Los enfoques de alto rendimiento revelaron una acumulación de transcripciones no codificantes del extremo 3’de los genes de ARNm y microRNA (miARN) en el mutante xrn3 knockdown, que puede corresponder a moléculas de lectura transcripcional . Por lo tanto, AtXRN3 puede participar en una vigilancia global de ARN 3’como resultado de su actividad de terminación de torpedos.

El mecanismo de torpedo depende de la actividad catalítica de exonucleasa de Rat1, y no simplemente de su presencia . El sustrato de ARN monofosforilado para Rat1 / Xrn2 durante la síntesis de ARNm se genera como resultado de una escisión cotranscripcional (CoTC) en el sitio de poliadenilación por la maquinaria de formación de extremo 3’de ARNm. Más precisamente, este proceso es realizado por el componente Ysh1 del CF II en levadura o la subunidad CPSF-73 correspondiente del factor de especificidad de escisión y poliadenilación humana (CPSF) (revisado en Ref. ). Se propusieron dos factores para contribuir a una rescisión eficiente: la fuerza de la señal de poli(A) y la acción de la exonucleasa degradando el producto de escisión de 5′, lo que facilita la pausa de la polimerasa aguas abajo del sitio de poli(A) y promueve su liberación . Por otro lado, la terminación deteriorada dependiente de la Rat1 no elimina el reconocimiento adecuado del sitio de poli(A) y la escisión del ARNm .

Los sitios de entrada adicionales de Rat1/Xrn2 pueden surgir a través del CoTC autocatalítico aguas abajo del sitio poli(A) en mamíferos o la escisión endonucleolítica por Rnt1 en levadura . Este último caso se informó como un mecanismo de terminación a prueba de fallos para genes codificadores de proteínas, que, junto con la vía mediada por el complejo Nrd1/Nab3/Sen1 (NRD), proporciona un modo de respaldo para la liberación de Pol II.

Aunque se requiere Rat1/Xrn2 para la terminación eficiente de Pol II, Rat1 no desencadena la terminación in vitro y su actividad de degradación de 5 ‘ -3 ‘ no es suficiente para promover la disociación de la polimerasa in vivo. Consistentemente, la levadura Xrn1 dirigida al núcleo es capaz de la degradación cotranscripcional del ARN naciente, pero no rescata los defectos de terminación causados por una deficiencia de Rat1. Estas observaciones sugieren que la exonucleasa ponerse al día con la polimerasa es necesaria pero no suficiente para desestabilizar el complejo de elongación, y que un elemento adicional del mecanismo de torpedos opera durante la terminación. Se ha postulado que una característica única de Rat1, el dominio de torre extendido, no presente en las proteínas Xrn1, puede ser responsable de sus propiedades de terminación . Es concebible que el dominio de la torre sufra ciertas modificaciones o sirva como interfaz para interacciones con factores que mejoran la terminación. Uno de los posibles candidatos para factores que estimulan la terminación dependiente de la rata 1 es la ARN helicasa Sen1, que es un componente clave de la vía de terminación para ARN no codificantes en levadura (ver más adelante) que también contribuye a la terminación de genes codificadores de proteínas, con el efecto más fuerte en ARN más cortos . Sen1 interactúa a través de su dominio N-terminal con la subunidad Pol II más grande, Rpb1 y la actividad de la helicasa Sen1 perjudica la distribución de Pol II en todo el genoma sobre genes codificantes y no codificantes . Se demostró que el homólogo Sen1 humano, Senataxina, promueve directamente la terminación de la transcripción mediada por Xrn2 al resolver los híbridos ARN: ADN(bucles R) formados detrás del Pol II alargado, predominantemente en sitios de pausa ricos en G aguas abajo del sitio poli (A). Esta actividad facilita el acceso de Xrn2 a productos de escisión de poli(A) sitio 3’ y, por lo tanto, contribuye al reclutamiento de la exonucleasa de torpedos. Se cree que el modo de acción de la levadura Sen1 es similar .

Una pregunta sin respuesta es cómo se recluta a Rat1 a la polimerasa elongante. Varias observaciones apoyan la asociación de Rat1 a través de proteínas que interactúan con el dominio C-terminal Pol II (CTD) a través de su dominio de interacción CTD (CID), a saber, la subunidad Pcf11 del factor de escisión de levadura IA (ACIA) y Rtt103 (regulador de la transposición Ty1 103). Rat1 y Rai1 están presentes en las regiones promotoras y codificantes con un fuerte enriquecimiento en los extremos 3’de los genes. Se demostró que la interacción funcional entre Rat1 y Pcf11 facilita el reclutamiento mutuo de ambos factores: Rat1 vincula la terminación con la formación de 3’al estimular el reclutamiento de factores de procesamiento de 3′, especialmente las subunidades ACIA Pcf11 y Rna15, mientras que Pcf11 contribuye a la asociación de Rat1 sobre el sitio poli(A). Además, se demostró que el Pcf11 humano mejora la degradación del ARN naciente y promueve la terminación de la transcripción . A su vez, Rtt103, que también se asocia cerca de los extremos 3’de los genes, copurifica con Rat1, Rai1 y Pcf11, y junto con Pcf11 reconoce cooperativamente la CTD fosforilada con Ser2 del Pol II elongante . Por otro lado, la distribución de Rat1 sobre los genes no se altera en ausencia de Rtt103 . Además, Rat1 también termina la transcripción por Pol I, que carece de un CTD, lo que sugiere que el reclutamiento de Rat1 también puede ocurrir a través de otros mecanismos. De hecho, se informó que la asociación de hXrn2 estaba mediada por p54nrb/PFS (factor de empalme asociado a proteínas), que son proteínas multifuncionales involucradas en la transcripción, el empalme y la poliadenilación . El papel de p54nrb / SLP en la terminación de la transcripción de Pol II también se demostró en C. elegans.

Además de los ARNm, Pol II sintetiza una amplia gama de transcripciones no codificantes, incluidos ARN y SNORN nucleares pequeños y una variedad de ARN inestables. En la levadura, la transcripción de estas especies relativamente cortas se termina principalmente por un complejo alternativo de NRD, compuesto por las proteínas de unión al ARN Nrd1 y Nab3 y la helicasa dependiente de ATP Sen1 . Dado que este mecanismo probablemente no implica una escisión endonucleolítica cotranscripcional , es la actividad de desenrollado híbrido ARN-ADN Sen1 la que se cree esencial para la disociación de la polimerasa, tal vez de una manera similar a la helicasa ADN–ARN Rho bacteriana. Rho probablemente desestabiliza el complejo de elongación al translocarse y eliminar el ARN naciente de la polimerasa . Un modelo alostérico alternativo postula que el Rho se carga sobre la polimerasa e induce reordenamientos en el sitio activo de la enzima en los sitios de terminación . Ambos modos de acción bien pueden aplicarse a la helicasa Sen1.

Aunque Rat1 es reclutado para genes de snoRNA, particularmente los intrónicos, la terminación dependiente de NRD de las transcripciones de snoRNA no se ve afectada cuando falta, y por lo tanto, se sugirió que participa en algunos eventos de terminación prematura . Todavía es posible, sin embargo, que el mecanismo de torpedo Rat1 pueda contribuir a la terminación de la transcripción de snoRNAs, como U3 o snR40, cuyo extremo 3’es liberado por la hendidura Rnt1 que expone el extremo 5’de la transcripción naciente restante para el ataque Rat1 .