El objetivo principal de la tinción negativa es estudiar la forma morfológica, el tamaño y la disposición de las células bacterianas que son difíciles de teñir. por ejemplo: Espirilla. También se puede usar para teñir células que son demasiado delicadas para ser fijadas por calor.
También se utiliza para preparar muestras biológicas para microscopía electrónica. Se utiliza para ver virus, bacterias, flagelos bacterianos, estructuras de membrana biológicas y proteínas o agregados de proteínas, que tienen un bajo poder de dispersión de electrones. También se utiliza para el estudio e identificación de agregados lipídicos acuosos como liposomas lamelares (le), micelas esféricas invertidas (M) y fases cilíndricas HII hexagonales invertidas (H) mediante microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa.
Principio de Tinción negativa
La tinción negativa requiere un tinte ácido como Tinta china o Nigrosina.
La tinta china o nigrosina es una mancha ácida. Esto significa que la tinción libera fácilmente un ion hidrógeno (protón) y el cromóforo del tinte se carga negativamente. Dado que la superficie de la mayoría de las células bacterianas está cargada negativamente, la superficie de la célula repele la mancha. El vidrio del portaobjetos se manchará, pero las células bacterianas no. Las bacterias aparecerán como manchas claras sobre un fondo oscuro.
Reactivos de Tinción negativa
Tinta china
Nigrosin
Nigrosin 100 gm/L, Formalina 5 ml / L en agua
Procedimiento de Tinción negativa
1. Coloque una gota muy pequeña (más de un bucle lleno, menos de una gota que caiga libremente del gotero) de nigrosin cerca de un extremo de un tobogán bien limpio y flameado.
2. Retire una pequeña cantidad del cultivo de la inclinación con un bucle de inoculación y dispérsela en la gota de mancha sin extender la gota.
3. Use otro portaobjetos limpio para extender la gota de mancha que contiene el organismo utilizando la siguiente técnica.
4. Apoye un extremo del portaobjetos limpio en el centro del portaobjetos con la mancha. Incline el portaobjetos limpio hacia la gota formando un ángulo agudo y dibuje el portaobjetos hacia la gota hasta que toque la gota y haga que se extienda a lo largo del borde del portaobjetos. Manteniendo un ángulo agudo pequeño entre las diapositivas, empuje la diapositiva del esparcidor hacia el extremo limpio de la diapositiva manchada arrastrando la gota detrás de la diapositiva del esparcidor y produciendo una mancha ancha, uniforme y delgada.
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5. Deje que la mancha se seque sin calentar.
6. Enfoque un área delgada bajo inmersión en aceite y observe las células sin teñir rodeadas por la mancha gris.
Procedimiento para ver en el Microscopio Electrónico de transmisión (TEM)
- Sostenga una rejilla recubierta con el borde hacia arriba en un par de pinzas de sujeción automática.
- Hacer una mezcla 1:1 de muestra y tinción negativa (p. ej. acetato de uranilo al 2% o fosfotungstato de sodio o potasio al 2%, pH 7,4). Añadir 5µl a la rejilla. Las partículas más pequeñas se adsorben a la superficie de la rejilla más rápidamente que las partículas más grandes.
Alternativamente, la muestra mezclada con fijador se puede agregar a la rejilla antes de la tinción negativa posterior. Incubar durante 30-90 segundos y retirar el exceso de líquido con el borde rasgado de un trozo de papel de filtro. - Secar al aire y examinar en el TEM.
Resultados de Tinción negativa
