Résumé
Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae) est une plante médicinale traditionnellement utilisée en Europe pour le traitement de divers troubles de la santé, en particulier comme collyre pour traiter les affections oculaires telles que la conjonctivite et la blépharite pouvant être associées à des infections bactériennes. Certaines espèces d’Euphrasia ont déjà été signalées pour contenir de l’huile essentielle. Cependant, la composition et la bioactivité de l’huile d’E. rostkoviana sont inconnues. Par conséquent, dans cette étude, nous avons étudié la composition chimique et l’activité antimicrobienne de l’huile essentielle d’eyebright contre certains organismes associés aux infections oculaires: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans. L’analyse GC-MS a révélé plus de 70 constituants, avec l’acide n-hexadécanoïque (18,47%) comme constituant principal suivi du thymol (7,97%), de l’acide myristique (4,71%), du linalol (4,65%) et de l’anéthole (4,09%). L’huile essentielle a montré un effet antimicrobien contre tous les organismes testés à l’exception de P. aeruginosa. La meilleure activité a été observée contre toutes les bactéries à Gram positif testées avec les concentrations inhibitrices minimales de 512 µg/mL. Il s’agit du premier rapport sur la composition chimique de l’huile essentielle d’E. rostkoviana et son activité antimicrobienne.
1. Introduction
Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae) est utilisée en Europe depuis des siècles comme médecine traditionnelle pour le traitement de diverses maladies. Les décoctions et infusions de parties aériennes en fleurs sont utilisées contre la toux sèche, l’enrouement, le traitement symptomatique du rhume, des maux d’oreilles et des maux de tête, du rhume des foins, des lésions cutanées purulentes ou des maladies catarrhales du tractus intestinal, mais surtout comme collyre pour traiter et prévenir les troubles oculaires tels que conjonctivite, blépharite, fatigue oculaire, inflammation oculaire purulente et sties. L’utilisation du thé eyebright a également été rapportée en médecine ethnovétérinaire pour le traitement de l’infection des yeux de vache. Malgré des siècles d’utilisation traditionnelle pour le traitement des affections oculaires, un seul essai de cohorte prospective a été réalisé confirmant l’efficacité du collyre Euphrasia dans le traitement de la conjonctivite et une seule étude clinique a étudié l’effet de l’application locale du collyre sur la consommation d’antibiotiques chez les nouveau-nés. De plus, jusqu’aux récents rapports sur l’activité anticandidale et antibactérienne de certains extraits d’Euphrasie, le spectre d’action antimicrobienne était complètement inconnu.
L’effet thérapeutique de E. rostkoviana peut être attribuée principalement à son activité antioxydante, anti-inflammatoire et antimicrobienne. Parmi les composés précédemment identifiés dans les extraits d’E. rostkoviana, l’apigénine, la lutéoline, le kaempférol, la quercétine, l’acide caféique, l’acide coumarique et l’acide rosmarinique peuvent être responsables de l’action antimicrobienne. Bien que la présence d’huile essentielle (OE) chez E. officinalis L. et E. stricta Kunt ait déjà été signalée, la composition et la bioactivité de l’OE d’E. rostkoviana sont inconnues. Par conséquent, dans cette étude, nous avons étudié la composition chimique et l’activité antimicrobienne de l’OE de l’œil droit contre le panel de trois bactéries à Gram positif (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus et S. epidermidis) et trois bactéries à Gram négatif (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa), et une levure (Candida albicans), organismes couramment associés à des infections oculaires.
2. Matériel et méthodes
2.1. Produits chimiques et matériel végétal
Les normes authentiques bornéol, camphre, carvacrol, carvone, caryophyllène, p-cymène, estragole, eucalyptol, limonène, linalol, menthol, menthone, β-myrcène, γ-terpinène et thymol pour l’identification des composants de l’OE ainsi que les antibiotiques témoins ciprofloxacine et tioconazole ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Prague, République tchèque). L’hexane (Merck, Prague, République tchèque), le diméthylsulfoxyde (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, République tchèque) et le Tween 80 (Sigma-Aldrich, Prague, République tchèque) ont été utilisés comme solvants. Le matériel végétal utilisé pour la distillation de l’OE a été acheté auprès de sources commerciales (F-DENTAL, Hodonín, République tchèque). L’OE a été extraite par hydrodistillation à l’aide d’appareils de type Clevenger.
2.2. Analyse chimique de l’OE par Chromatographie en phase Gazeuse – Spectrométrie de masse (GC-MS)
L’OE d’E. rostkoviana a été analysée par GC-MS à l’aide d’un GC Agilent 7890A couplé à un détecteur de masse quadripolaire Agilent 5975C équipé d’une colonne HP-5MS (film de 30 m × 0,25 mm, 0,25 µm) d’Agilent (Santa Clara, CA, USA). L’hexane a été utilisé comme solvant et le volume d’échantillon de 1 µL a été injecté en mode split (rapport 20:1) dans l’injecteur chauffé à 250°C. La température du four de départ a été réglée à 60°C pendant 3 min, programmée à 230°C à raison de 3°C/min, puis maintenue constante pendant 10 min. L’hélium a été utilisé comme gaz porteur avec un débit de 1 mL/min. L’analyse MS a été réalisée en mode balayage complet et l’énergie d’ionisation des électrons a été fixée à 70 eV. L’identification des composants individuels a été basée sur la comparaison de leurs spectres de masse et de leurs indices de rétention relative avec la bibliothèque et la littérature du National Institute of Standards and Technology (NIST, États-Unis), ainsi que sur la coinjection de la norme authentique.
2.3. Souches bactériennes et Milieux de culture
Les souches standard de trois bactéries à Gram positif Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 et S. epidermidis ATCC 12228, trois bactéries à Gram négatif Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et une levure Candida albicans ATCC 10231 ont été obtenues à partir d’Oxoid (Basingstoke, Royaume-Uni). Le bouillon Mueller-Hinton ajusté aux cations (MHB) et le bouillon dextrose Sabouraud (SDB) ont été utilisés comme milieu de culture pour le dosage de microdilution antibactérien et antifongique, respectivement, et ont été équilibrés avec une solution saline tamponnée Tris (Sigma-Aldrich, Prague, République tchèque). La gélose Mueller-Hinton (MHA) et la gélose Sabouraud dextrose (SDA) ont été utilisées pour la détermination ultérieure des concentrations bactéricides et fongicides, respectivement. Tous les supports ont été achetés auprès d’Oxoid (Basingstoke, Royaume-Uni).
2.4. Détermination de la Concentration minimale inhibitrice (CMI)
Les CMI ont été déterminées à l’aide de la méthode de microdilution de bouillon in vitro suivant les directives du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) modifiées selon les recommandations proposées pour une évaluation efficace du potentiel anti-infectieux des produits naturels à l’aide de plaques de microtitres à 96 puits. Brièvement, l’OE a été dissous dans du DMSO avec ajout de Tween 80 et des dilutions en série doubles ont été préparées dans du MHB pour les bactéries et dans du SDB pour la levure alors que les concentrations testées allaient de 4 à 2048 µg/mL. L’inoculum a été préparé à partir de cultures nocturnes de sorte que les concentrations initiales d’UFC dans les microplaques étaient respectivement de 5 × 105 et 2 × 103 UFC/mL pour les bactéries et les levures. Les plaques inoculées ont été examinées après 24 h d’incubation à 35°C et de nouveau après 48 h dans le cas de C. albicans. La croissance microbienne a été mesurée par spectrophotométrie par photomètre à microplaques Multiscan Ascent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) à 405 nm. Les CMI ont été exprimées comme les concentrations les plus faibles capables d’inhiber ≥ 80% de la croissance bactérienne par rapport au témoin de croissance positif. Les expériences ont été réalisées en trois exemplaires dans trois tests indépendants et les valeurs médianes ont été utilisées pour le calcul des MICs. En raison de la possibilité récemment signalée d’une influence des composants volatils de l’OT sur la croissance microbienne dans les puits adjacents, des rangées de contrôle de croissance positif ont été insérées entre les rangées de dilution de l’OT pour détecter une éventuelle influence de la croissance. Les solvants utilisés n’ont pas inhibé la croissance bactérienne aux concentrations testées. La ciprofloxacine et le tioconazole ont été utilisés comme antibiotiques de référence pour les bactéries et les levures, respectivement.
2.5. Détermination de la Concentration Bactéricide Minimale (MBC) et de la Concentration Fongicide Minimale (MFC)
Les aliquotes de 20 µL ont été transférées de chaque puits sans croissance microbienne vers les plaques MHA (plaques SDA pour C. albicans) après 24 h et 48 h d’incubation des bactéries et des levures testées, respectivement. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 24 h à 35°C. Le MBC et le MFC ont été évalués comme une diminution ≥99,9% de CFU par rapport à l’inoculum, tous réalisés en trois exemplaires dans trois tests indépendants.
3. Résultats et discussion
3.1. Caractérisation chimique des Constituants des Huiles et des Fractions bioactives
L’hydrodistillation EO par un appareil de type Clevenger a donné 0,02% (p / v) d’huile brun jaunâtre qui a tendance à se solidifier à température ambiante, ce qui est probablement dû à une forte proportion d’acides gras (32,23% au total). L’analyse GC-MS de l’OE a révélé la présence de plus de 70 constituants, l’acide palmitique (18,47%) étant le composant le plus abondant suivi du thymol (7,97%), de l’acide myristique (4,71%), du linalol (4,65%), de l’anéthole (4,09%), de l’acide linolénique (3,81%), de l’hexahydrofarnésylacétone (3,16%), de l’acide laurique (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.
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| R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identification basée sur la coinjection de l’échantillon authentique; d: identification provisoire. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
La teneur élevée en acides gras a précédemment été trouvée dans l’E. stricta EO (25,7% au total) avec également la plus forte proportion d’acide palmitique (20,3%) et d’acide myristique (3,9%). Cependant, il n’y a pas d’autre composé présent en quantité significative qui indiquerait la parenté de ces deux espèces d’Euphrasie.
3.2. Activité antimicrobienne
L’E. l’OE de rostkoviana a montré une activité contre six organismes sur sept testés avec des CMI allant de 512 à 2048 µg / mL. Les bactéries à Gram positif étaient plus sensibles que les bactéries à Gram négatif et la levure alors que P. aeruginosa était le seul organisme qui n’était pas inhibé par l’huile aux concentrations les plus élevées testées. Les CMI, les CMB et les CMF de l’OT par rapport à tous les microorganismes testés sont résumés dans le tableau 2. Les concentrations actives sont comparables à celles précédemment rapportées pour, par example, EOs d’Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum ou Thymus vulgaris, notamment en cas d’activité anticandidale. L’huile était également plus efficace que les extraits d’E. rostkoviana testés par Teixeira et Silva contre E. coli, E. faecalis, S. aureus et S. epidermidis. Les CMI des antibiotiques de référence contre les bactéries et levures sensibles à l’E. l’OT de rostkoviana était conforme aux limites acceptables de la CLSI et aux rapports précédents, respectivement.
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| The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Étant donné que la teneur en acide palmitique constituant principal de l’OE ne dépasse pas 20% et qu’il existe plus de 10 autres composés antimicrobiens actifs allant de 1 à 8%, il est difficile de suggérer les principaux agents responsables de l’effet antimicrobien de l’OE E. rostkoviana. L’acide palmitique a déjà été identifié comme le principal composé de fractions actives contre les bactéries Gram-négatives, mais non Gram-positives. D’autre part, les acides gras saturés à chaîne moyenne et les acides gras insaturés à longue chaîne sont connus pour inhiber notamment les bactéries à Gram positif. De plus, l’acide laurique exerce également une activité contre un certain nombre de champignons. Ainsi, l’activité antimicrobienne de l’OE est probablement due à une action complexe des acides gras antimicrobiens avec les autres composés antimicrobiens bien connus identifiés dans l’OE tels que l’anéthole, le bornéol, le camphre, le carvacrol, le linalol, le menthol, l’α-terpinéol ou le thymol.
4. Conclusions
En conclusion, l’analyse chimique a révélé un certain nombre de substances antimicrobiennes actives présentes dans l’E. rostkoviana EO et son activité antifongique et antibactérienne contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives ont été confirmées. À notre connaissance, il s’agit du premier rapport sur la composition et l’activité antimicrobienne d’E. rostkoviana EO.
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.
Remerciements
Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Européenne pour la Science et le Projet CZ du Ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République Tchèque.1.07/2.3.00/30.0040; par la subvention S du Ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République Tchèque; et par le Projet IGA 20155012 de l’Université Tchèque des Sciences de la Vie de Prague. Les auteurs sont reconnaissants à Slavka Barlakova pour la relecture de l’anglais.