Les bactériophages, également appelés phages, sont des virus qui infectent spécifiquement les bactéries et nous pouvons confirmer leur présence et les quantifier à l’aide d’un outil appelé dosage de la plaque. Les bactériophages infectent leurs hôtes sensibles en s’attachant d’abord à la paroi cellulaire bactérienne et en injectant leur matériel génétique. Ensuite, ils détournent la machinerie biosynthétique de la cellule pour répliquer leur ADN et produire de nombreuses particules de phage de descendance, qu’ils libèrent ensuite en lysant et en tuant la cellule hôte.
Cette activité lytique est à la base d’une technique largement utilisée de dénombrement des phages connue sous le nom de test de plaque ou test de double couche de gélose. Ici, un mélange de bactériophages est d’abord préparé dans un bouillon nutritif fondu contenant de la gélose à faible concentration. Toutes les bactéries utilisées dans le mélange doivent être vivantes et se diviser activement dans la phase log de leur croissance, ce qui garantira qu’un grand pourcentage des bactéries sont viables et capables de former une pelouse dense autour des plaques. Ensuite, ce mélange de gélose bactérien-phage fondu est étalé sur un milieu nutritif de gélose concentré plus solide qui est déjà solidifié sur une boîte de Pétri. Lors de l’incubation à température ambiante, le bouillon d’agar-phages-bactéries à faible concentration se solidifie également pour former une couche d’agar molle.
Ici, les cellules bactériennes peuvent tirer des nutriments supplémentaires de la couche inférieure et devraient se multiplier rapidement pour produire une pelouse confluente de bactéries. Cependant, comme des particules de phage sont également présentes dans la couche molle, celles-ci infecteront et répliqueront leur matériel génétique au sein de la bactérie, aboutissant à la lyse cellulaire, qui libère de multiples descendants. Ces descendants de phages infectent alors les cellules voisines, car l’état semi-solide de la couche de phages bactériens limite leur mouvement vers des cellules hôtes situées plus loin. Ce cycle d’infection et de lyse se poursuit sur plusieurs cycles, tuant un grand nombre de bactéries dans une zone localisée. La destruction des cellules voisines a pour effet de produire une seule zone claire circulaire, appelée plaque, visible à l’œil nu, amplifiant efficacement l’activité lytique bactérienne du phage et permettant leur dénombrement.
Le nombre de plaques sur une boîte de Pétri est appelé Unités formant plaque, ou PFU, et, à condition que la concentration initiale de bactériophages soit suffisamment diluée, doit correspondre directement au nombre de particules de phages infectantes dans l’échantillon initial. Cette technique peut également être utilisée pour la caractérisation de la morphologie des plaques, pour faciliter l’identification des types de phages ou pour isoler des mutants de phages. Dans ce laboratoire, vous apprendrez à effectuer le dosage de la plaque pour dénombrer les phages, en utilisant le phage T7 d’E. coli comme exemple.
Tout d’abord, identifier un milieu approprié pour la culture des cellules bactériennes hôtes et du bactériophage. Ici, le bouillon de lysogénie, ou milieu LB, a été utilisé pour cultiver E. coli et le phage T7. Ensuite, prenez trois bouteilles en verre propres et étiquetez-les avec un support, un nom, puis la première comme bouillon LB, la seconde comme gélose LB-Bottom et la troisième comme gélose LB-Top. Maintenant, pesez quatre grammes de poudre LB pré-formulée en trois séries, puis transférez un ensemble de milieux séchés pesés dans chaque bouteille. Ajoutez 200 millilitres d’eau à la première bouteille. Mélanger le contenu à l’aide d’une barre d’agitation magnétique.
Ensuite, à l’aide d’un pH-mètre et sous agitation constante, porter le pH final à 7,4 par addition d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique. Répétez également l’addition d’eau et l’ajustement du pH pour les deux autres bouteilles restantes. Maintenant, pesez trois grammes de poudre d’agar et ajoutez-la à la deuxième bouteille pour obtenir une gélose de fond à 1,5%. Enfin, pesez 1. 2 grammes de gélose et ajoutez-le à la troisième bouteille pour faire le.Gélose supérieure de 6% LB. La condition de bouillon dans la bouteille one n’a pas besoin d’un ajout de gélose. Boucher la bouteille semi-hermétiquement, puis stériliser le support en autoclavant à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois terminé, retirez les bouteilles de média de l’autoclave et tournez immédiatement les bouchons pour les fermer complètement afin d’éviter toute contamination. Conservez le milieu de gélose LB-Broth et LB-Top sur le banc pour une utilisation ultérieure. Placez la gélose LB-Bottom pour la refroidir dans un bain-marie préréglé à environ 45 degrés Celsius.
Lorsque la gélose LB-Bottom atteint environ 45 degrés Celsius, transférez-la sur le banc de travail. Ensuite, stérilisez l’espace de travail en utilisant 70% d’éthénol. Ensuite, ajoutez 450 microlitres de chlorure de calcium stérile à une molaire à la gélose fondue pour obtenir une concentration finale de 2.25 millimolaires. Faites tourner doucement la bouteille pour mélanger. Ensuite, préparez sept boîtes de Pétri propres. Étiquetez chaque plat sur le fond avec le nom du support et la date de préparation. Ensuite, versez 15 millilitres de gélose de fond dans chacune des sept boîtes de Pétri. Laisser les plaques reposer pendant quelques heures ou toute la nuit à température ambiante. Une fois fixées, les plaques de culture peuvent être stockées à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours si nécessaire, à l’envers pour minimiser la condensation. Transférer les boîtes de Pétri du réfrigérateur à quatre degrés Celsius dans un incubateur à 37 degrés Celsius une heure avant l’analyse.
La veille du préformage du test, l’E. coli doit être cultivé. Ici, 10 microlitres de culture d’E. coli ont été inoculés dans 10 millilitres de bouillon LB. Placez les bactéries à pousser pendant la nuit dans un incubateur agitant réglé à 37 degrés Celsius à 160 tr / min. Puis, le jour du test, retirez la culture bactérienne de l’incubateur. Ensemencer 10 millilitres de bouillon LB frais avec 0,5 millilitres de la culture de nuit. Placez ces cellules pour les transformer en un incubateur agitant réglé à 37 degrés Celsius à 160 tr / min. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre pour vérifier lorsque cette culture atteint une croissance en phase log, indiquée par une densité optique de 0,5 à 0,7. Une fois que la DO atteint ce niveau, arrêtez l’incubation en transférant la culture cellulaire au banc. Ils sont maintenant prêts à être utilisés pour le test de superposition de phages.
Les titres de phages peuvent varier de façon exponentielle selon les types de phages et les échantillons. Ainsi, afin de les compter efficacement, ils doivent être dilués pour générer une large gamme de concentrations de phages. Le jour de l’essai, générer une série de dilutions de phages allant d’un dixième à un millionième de concentrations, suivant une technique de dilution par 10 fois. Pour obtenir des données statistiquement significatives et précises, effectuez la dilution en série en trois exemplaires.
Ensuite, faites fondre la gélose LB-top solidifiée à l’aide d’un micro-ondes. Ensuite, placez-le dans un bain-marie préréglé à 45 degrés Celsius pendant une heure. Après une heure, récupérez les boîtes de Pétri contenant la couche de gélose inférieure de l’incubateur. Étiquetez les plaques avec la concentration en phages et la date de dosage. Ensuite, exposez sept tubes à essai propres. Étiqueter chaque tube à essai avec le numéro de dilution du phage en série et en désigner un comme témoin.
Lorsque la gélose LB-top atteint 45 degrés Celsius, transférez-la sur le banc de travail. Maintenant, ajoutez 450 microlitres d’un chlorure de calcium molaire à la gélose de 200 millilitres pour obtenir une concentration finale de 2,25 millimolaires. Faites tourner doucement la bouteille pour mélanger. Ensuite, ajoutez 35 millilitres de gélose LB-top et quatre millilitres de suspension bactérienne dans un tube conique stérile. Tourbillonnez doucement pour répartir uniformément les cellules, mais évitez de les secouer pour éviter la formation de mousse.
Maintenant, aliquotez cinq millilitres de ce mélange de gélose à base de bactéries dans chacun des sept tubes à essai. Ensuite, transférez 100 microlitres des échantillons de bactériophage dilués en série et des milieux de contrôle, qui doivent être simplement des milieux sans bactériophage, dans les tubes à essai respectueusement étiquetés. Agiter doucement le mélange pour assurer un mélange correct. Transférer délicatement cinq millilitres de mélange bactériophage sur la plaque de pétri respective. Répartir uniformément le mélange sur toute la surface en faisant tourner doucement la plaque de pétri.
Une fois que toutes les plaques de pétri sont en couches avec le mélange, permettre la solidification de la couche supérieure en incubant à température ambiante pendant 15 minutes. Une fois ces étapes terminées, répétez le processus pour les deuxième puis troisième séries de boîtes de Pétri en utilisant les deux séries restantes de dilutions de phages. Sceller chaque plat avec du parafilm et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Placez la plaque de culture à l’envers à une température appropriée pendant 24 heures ou jusqu’à ce que les plaques se développent. Ici, les plaques ont été placées dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une journée, une condition de croissance stimulante pour E. coli et le phage T7.
Les plaques apparaîtront après un à cinq jours d’incubation, selon l’espèce bactérienne, les conditions d’incubation et le choix du milieu. Ici, les plaques étaient visibles après une journée d’incubation à 37 degrés Celsius. Commencez par vérifier les plaques marquées contrôle et assurez-vous qu’aucune plaque ne s’est formée dans ces plaques, car cela indiquerait une contamination virale. Pour déterminer le titre de phage de l’échantillon d’origine, commencez par les plaques contenant l’échantillon de phage le plus dilué et comptez les plaques sans retirer les couvercles, en les marquant pour indiquer celles qui ont déjà été comptées. Répétez le comptage pour chaque plaque dans chaque ensemble. Certaines plaques peuvent avoir trop ou trop peu de plaques pour être comptées. Considérez 10 à 150 comme un nombre de plaques idéal.
Ensuite, générez un tableau répertoriant les valeurs du numéro de plaque pour les différentes dilutions et répliques. Ensuite, calculez les valeurs moyennes du nombre de plaques pour les plaques de dilution contenant le nombre idéal de plaques. Dans cet exemple, il s’agissait du nombre moyen de plaques formées dans les plaques de dilution 10 à moins trois et 10 à moins quatre. Maintenant, ajustez le facteur de dilution du phage en divisant les valeurs moyennes de plaque obtenues par les facteurs de dilution du phage respectifs. Ici, le nombre moyen de plaques formées aux 10 aux moins trois et aux 10 aux moins quatre plaques de dilution, ont été divisés par leurs facteurs de dilution respectifs pour obtenir le nombre d’unités de formation de plaques, ou PFU, dans 100 microlitres de mélange de phages. Pour convertir la valeur en PFU par millilitre, multipliez les valeurs générées par 10, car seulement 100 microlitres de mélange de dilution de phages ont été utilisés pendant l’étape de préparation de la superposition de bactériophages, produisant un facteur de dilution supplémentaire de 10. Enfin, calculez la moyenne des valeurs obtenues à partir des différentes plaques de dilution. Cela donnera le nombre moyen de PFU par millilitre. Le nombre de PFU correspond au nombre de particules de phage infectantes dans l’échantillon d’origine.