Les HNSCC positifs et négatifs au VPH/ p16 montrent des différences dans l’implication nodale
Nous avons déterminé le statut HPV et p16 de 241 patients atteints de carcinome épidermoïde oropharyngé (OPC) traités par rayonnement (chimio) (c) RT. Les échantillons de tumeurs humaines ont été acquis selon des protocoles approuvés par le conseil d’éthique des Hôpitaux Universitaires de Louvain (Louvain, Belgique) et le consentement implicite de tous les patients a été obtenu. Les données clinicopathologiques ont été extraites des dossiers des patients et le temps de suivi moyen était de 4,19 ans. Les patients positifs au VPH ont été caractérisés par des stades T inférieurs avec 45% (26 sur 58; p = 0,025) de patients positifs au VPH présentant des tumeurs au stade T1 / 2 alors que ce pourcentage était de 29% (51 sur 175; p = 0,025) dans le groupe négatif au VPH. De plus, les tumeurs positives au VPH étaient significativement plus élevées (p = 0.014) atteinte nodale chez 72% (42 sur 58) des patients positifs au VPH présentant des tumeurs N2/N3 alors que ce n’était que 54% (95 sur 175) dans le groupe négatif au VPH. Bien que la relation entre le statut p16 et le stade N n’était pas significative, une tendance à une implication nodale plus élevée et à une positivité p16 a été observée. Soixante-trois% des patients p16 positifs présentaient des tumeurs N2 / N3, alors que ce n’était que 54% dans le groupe p16 négatif (tableau 1). Ces résultats sont en concordance avec d’autres études, montrant que les patients HNSCC positifs au VPH ont des stades N et T plus élevés.
Comme prévu, de faibles stades T ont entraîné de meilleurs taux de contrôle à distance (DC) avec des taux de contrôle à 5 ans de 83% et 70% (p = 0,04) pour Tumeurs T1/T2 et T3/4 respectivement (Fichier supplémentaire 1: Figure S1A). Les tumeurs N2 / 3 (DC à 5 ans 70%; p = 0,02) présentaient un risque plus élevé d’échec à distance par rapport aux tumeurs N0 / 1 (taux DC à 5 ans 85%; p = 0,02) (Fichier supplémentaire 1: Figure S1B). Aucune différence statistiquement significative n’a été observée dans le taux de DC entre la maladie positive et négative du VPH (taux de DC sur 5 ans de 82% vs taux de DC sur 5 ans de 72% respectivement; p = 0,20) (fichier supplémentaire 1: Figure S1C). Bien que non significative, cette différence de 10% dans les taux de DC suggère une influence du virus au-delà du contrôle tumoral local. De plus, il indique la présence de modèles de dissémination différents entre HPV HNSCC positif et négatif.
p16 réprime la capacité d’invasion et de migration du HPV HNSCC positif
Pour étudier le mécanisme moléculaire à l’origine de ces différences potentielles observées dans les métastases dans notre cohorte de patients, nous avons évalué la migration in vitro et la capacité d’invasion des cellules HNSCC. Les cellules HPV/p16 positives SCC154 et SCC104 ont montré un taux de migration significativement plus faible par rapport aux cellules HPV/p16 négatives SQD9, CAL27 et SC263 (Fig. 1 bis). En accord avec le test de migration, les cellules positives HPV/p16 ont montré des capacités d’invasion réduites par rapport aux cellules négatives HPV/p16 (Fig. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). d Capacité d’invasion de cellules SCC154 positives au VPH traitées avec shRNA pour p16 (shp16) et contrôle (shluc). (a-d) Le résultat est représenté par la moyenne ± SEM de trois expériences et les valeurs de p sont calculées par un test t bilatéral
Le suppresseur de tumeur p16 est un régulateur de cycle cellulaire bien connu et un bon marqueur de substitution pour le HPV HNSCC positif. De plus, des données récentes attribuent un rôle plus large à p16, y compris un rôle dans la migration et la répression de l’angiogenèse. Par conséquent, nous avons également examiné l’influence de p16 sur la capacité de migration et d’invasion des cellules SCC154 positives au VPH manipulées avec de l’ARN en épingle à cheveux courte (shRNA) pour p16 (shp16) et des shRNA témoins (shluc). Régulation à la baisse de l’expression de p16 augmentation des capacités de migration et d’invasion des cellules SCC154 (Fig. 1c et d). Ces données vérifient la présence de différences dans les schémas de dissémination entre HPV HNSCC positif et négatif et suggèrent un rôle actif de p16 dans la cascade métastatique.
p16 supprime la migration et l’invasion par angiogenèse dans le HPV HNSCC positif
Il est bien connu que l’angiogenèse, qui est activement soutenue dans les cellules cancéreuses par des facteurs pro-angiogéniques tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGFA), est un conduit pour la propagation des cellules cancéreuses et les métastases et favorise la progression tumorale agressive. De plus, la corrélation négative entre HPV/p16 et VEGFA est précédemment décrite dans HNSCC. Par conséquent, nous avons évalué la relation entre le VPH, le p16 et le VEGFA dans notre cohorte de patients. Les patients positifs au VPH ont montré une expression de VEGFA significativement plus faible, 54 % (28 sur 51) des patients ne présentant aucune expression de VEGFA ou une expression de VEGFA faible par rapport à 32 % (53 sur 161) dans le groupe négatif au VPH (tableau 2). Bien que la corrélation négative entre VEGFA et p16 soit moins prononcée, une tendance à la signification a été observée (tableau 2).
Nous avons étudié plus avant la relation entre l’angiogenèse et la p16 avec des xénogreffes in vivo injectées avec des cellules positives au VPH SCC154 manipulées avec shp16 ou shluc. Un nombre plus élevé de vaisseaux sanguins a été détecté chez les tumeurs de souris avec une faible expression de p16 par rapport aux tumeurs témoins (Fig. 2 bis). De plus, l’augmentation de la vascularisation a entraîné une nécrose plus faible, un nombre plus élevé de cellules mitotiques et un avantage de croissance des tumeurs exprimant le shp16 (fichier supplémentaire 2: Figure S2A-C). Nous n’avons pas pu vérifier l’implication de p16 dans la suppression des métastases in vivo en raison de l’absence de modèle animal métastatique. Cependant, l’avantage de croissance et l’augmentation de la vascularisation observée chez les tumeurs de souris shp16 peuvent expliquer l’apparition fréquente de stades T avancés chez les patients HNSCC négatifs au VPH.
Double rôle de p16 dans la dissémination du HNSCC. une formation de vaisseaux sanguins dans les modèles de souris à xénogreffe SCC154 shp16 et SCC154 shluc évalués par coloration au CD31 (au-dessus du graphique); n = 5. b Nombre moyen de formation de vaisseaux lymphatiques dans les modèles de souris xénogreffes SCC154 shp16 et SCC154 shluc évalués par coloration LYVE-1 (au-dessus du graphique); n = 5. c Score moyen de la coloration de l’intégrine béta1 alpha4 dans les modèles de xénogreffe de souris SCC154 shp16 et SCC154 shluc; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. les valeurs a-d P sont calculées par un test t bilatéral
p16 stimule la lymphangiogenèse et la propagation nodale chez les patients HNSCC positifs au VPH
Ces résultats n’expliquent toujours pas l’apparition de taux de rechute à distance similaires chez les patients HNSCC positifs et négatifs au VPH / p16 et n’expliquent certainement pas la association entre la positivité au VPH et l’implication nodale décrite dans notre étude et dans plusieurs autres études. Ceci est particulièrement important car il implique la présence d’un potentiel métastatique local élevé dans le HNSCC positif au VPH. Il est intéressant de noter que la lymphangiogenèse, comme l’angiogenèse, favorise les métastases tumorales en induisant la croissance de nouveaux vaisseaux lymphatiques à l’intérieur de la tumeur et en améliorant le trafic cellulaire vers les ganglions lymphatiques. De plus, l’augmentation de la densité des vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs est associée à une augmentation des métastases aux ganglions lymphatiques. . Par conséquent, nous avons évalué la formation de vaisseaux lymphatiques par immunocoloration homologue de l’hyaluronane (LYVE-1) dans des tumeurs de souris shluc et shp16. Nous avons constaté que la suppression de la p16 entraînait une densité vasculaire lymphatique plus faible dans les xénogreffes positives au VPH/p16, suggérant un double rôle de la p16 dans les métastases (Fig. 2b).
Pour comprendre la fonction de p16, nous nous sommes concentrés sur les intégrines car ces protéines sont acceptées comme régulateurs clés de l’angiogenèse et de la lymphangiogenèse. De plus, la liaison de p16 aux intégrines et la perte de propagation cellulaire sont précédemment documentées. Les intégrines telles que alpha4 beta1 sont des modulateurs importants de la lymphangiogenèse. Par conséquent, nous avons évalué la présence d’intégrine alpha4 beta1 dans les tumeurs de souris SCC154 shluc et SCC154 shp16. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).