Cinq variantes de Pax-6 et leurs modèles d’expression dans des embryons de calmar et des tissus oculaires adultes

Nous avons effectué une seule PCR de RACE 3′ pour le gène Pax-6 du calmar pygmée (désigné IpPax-6) pour étudier les variantes d’épissage et les loci multiples de Pax-6. 6 chez les céphalopodes coléoïdes. Nous avons constaté qu’il n’y avait pas de locus multiples chez le calmar pygmée, mais nous avons identifié trois variantes Pax-6 de longueurs discrètes. Les différences dans les séquences d’acides aminés parmi ces variantes de Pax-6 étaient limitées à des régions limitées. Par conséquent, ils ont été supposés être le résultat d’événements d’épissage alternatifs d’un seul locus. Nous avons ensuite validé la présence de variantes d’épissage à l’aide de la RT-PCR et nous avons finalement obtenu cinq types de variantes d’épissage, dont une orthologie apparente du Pax-6 authentique (Figure 1). La longueur et la structure de l’IpPax-6 authentique étaient similaires à celles des gènes Pax-6 trouvés chez d’autres espèces de calmars, Euprymna scolopes et Loligo pealei15,16. L’IpPax-6 authentique (forme authentique, 499 aa) comprend deux domaines de liaison à l’ADN indépendants, les domaines PD et HD et un domaine riche en P / S / T (PST) C-terminal, qui est l’activateur dédié avec une protéine trans-activatrice partenaire, comme le montre de nombreux animaux (Figure 1). La similarité des séquences protéiques et l’arbre phylogénétique ont confirmé que IpPax-6 était un orthologue de la mouche ey et du vertébré Pax-4/6 (figure supplémentaire 1). Les quatre variantes identifiées ont produit des protéines de longueurs différentes de celles de l’IpPax-6 authentique (Figure 1).

Pour explorer l’expression spécifique au stade des variantes de squid Pax-6, nous avons effectué une PCR Q pour divers tissus et à différents stades embryonnaires en utilisant des amorces conçues pour cibler les exons supplémentaires d’IpPax-6 (Figure 2 & Figure S2). Les œufs de calmars présentent une gastrulation épibolique et un développement direct sans stade larvaire typique du mollusque17. Les yeux embryonnaires apparaissent à partir de l’épiderme externe du blastodisque et sont différentiables après le stade 18, la pigmentation rétinienne commençant au stade 20. La lentille apparaît sous la forme d’une structure transparente en forme de bâtonnet visible à l’œil nu au stade 25. Nous avons d’abord effectué une Q-PCR en utilisant des amorces ciblant l’exon 2, qui couvre les cinq variantes. L’analyse Q-PCR a montré que l’IpPax-6 était exprimé au stade 16 avant la formation de vésicules oculaires (Figure 2A). L’intensité d’expression d’IpPax-6 a été progressivement régulée à la hausse avec le développement de l’embryon de calmar (Figure 2A), le globe oculaire présentant les intensités d’expression les plus élevées parmi les tissus testés. Comme observé chez les autres animaux bilateriens, les formes authentiques et variantes d’IpPax-6 ont été exprimées à des niveaux nettement déprimés dans le tissu musculaire. Nous avons ensuite utilisé des amorces ciblant des variantes dépourvues d’exon 4 (variantes 1 et 3, Figure 2B). Les amorces ont détecté des variants 1 et 3 à des niveaux faibles dans les embryons au stade 16 et dans le tissu du globe oculaire. Nous avons également utilisé des amorces ciblant des variantes, y compris l’exon 6 (variantes 2 et 3, Figure 2C). L’analyse Q-PCR a montré que les variants 2 et 3 étaient exprimés dans les globes oculaires et les lobes optiques ainsi que dans les embryons aux stades 16 et 25. Comme la formation des cellules photoréceptrices et du cristallin commence chez les embryons au stade 25, les variants incluant l’exon 6 peuvent contribuer au développement oculaire. Les résultats démontrent que les modèles d’expression des variantes d’IpPax-6 différaient significativement de ceux de l’IpPax-6 authentique.

Pour distinguer les variantes présentes à chaque étape, nous avons effectué une RT-PCR en utilisant des ensembles d’amorces à travers les limites des exons. La variante 1 a été considérée comme exprimée à tous les stades embryonnaires ou à certains stades embryonnaires, mais pas dans les yeux adultes (figure supplémentaire 2). L’analyse RT-PCR a également montré que la variante 4 était fortement exprimée dans les yeux adultes, en particulier dans la rétine, mais pas dans les lentilles (figure supplémentaire 2A). Les variants 2 et 3 ont été exprimés à tous les stades embryonnaires ainsi que dans les tissus adultes (figure supplémentaire 2B).

Pour identifier l’expression tissulaire spécifique des variants d’IpPax-6, nous avons effectué une hybridation in situ à l’aide de sondes d’ARN conçues pour se lier spécifiquement à chaque variant (Figure 2D-G). La sonde d’ARN conçue à partir de l’exon 2 cible les cinq variantes identifiées dans cette étude. La sonde ARN conçue à partir de l’exon 4 lié à la forme authentique et aux variants 2 et 4. L’IpPax-6 s’est avéré localisé dans la région du cerveau, y compris le lobe basal dorsal, le lobe frontal supérieur, les lobes pédonculaires/olfactifs et les lobes optiques (Figure 2D–G), comme décrit dans Hartmann et al.18 Le tissu extérieur à la rétine (correspondant peut-être à la future couche d’iridophores) a également clairement exprimé l’IpPax-6 au stade 22 (Figures 2D et 2D’). L’expression d’IpPax-6 a été observée dans cette couche jusqu’au stade 25. L’hybridation in situ utilisant la sonde ciblant l’exon 4 a suggéré que les variantes 2 et 4 avaient des schémas d’expression similaires dans le cerveau mais pas dans les yeux (Figure 2E). Cette découverte suggère que les variantes 1 et 3 (dépourvues de l’exon 4) sont régulées à la hausse dans la couche externe des yeux. Ces conséquences impliquent que chaque variante d’IpPax-6 est régulée indépendamment à travers les processus de formation des yeux.

Structure exon-intron de Pax-6 chez d’autres céphalopodes/mollusques

Nous avons étudié si ce type d’épissage alternatif n’était acquis que chez les céphalopodes coléoïdes. En appliquant l’analyse RT-PCR aux ARN embryonnaires du calmar japonais (Loligo bleekeri), nous avons trouvé trois types d’ARNM pouvant provenir d’un épissage alternatif (saut de l’exon 4, insertion de l’exon 3 et insertion de l’exon 6) dans les yeux (Figure 3A, B). Les exons 3 et 6 insérés codent respectivement 20 et 40 acides aminés, tandis que l’exon 4 sauté codait 51 acides aminés. Pour étudier la présence d’un épissage alternatif similaire dans d’autres génomes de mollusques, nous avons examiné les structures exon-intron de Pax-6 chez la patate douce et l’huître perlière. La séquence génomique complète de la chouette limpette (Lottia gigantea, obtenue à partir du portail génomique JGI Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 et de l’huître perlière (Pinctada fucata, obtenue à partir de l’Unité génomique marine de l’OIST genome browser P. fucata_ver1.0, transcription: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, échafaudage 8418.1) 20 a montré que le mollusque Pax-6 a cinq exons. L’exon 4 du calmar a été conservé parmi les espèces de mollusques testées. Cependant, les exons 3 et 5 n’ont pas été trouvés dans le gène Pax-6 de l’huître perlière. Ainsi, nous avons constaté que les variantes 2 et 4 ont été acquises dans la lignée des céphalopodes coléoïdes (Figure 1).

À notre connaissance, notre étude est la première à rapporter des variantes d’épissage in-frame de squid Pax-6 qui ont été exprimées différemment selon le stade embryonnaire. Des études antérieures ont isolé des types discrets de variantes d’épissage qui avaient perdu la moitié N-terminale du domaine PD chez d’autres espèces de calmars 15,18, mais ces variantes n’ont pas montré de différences spatio-temporelles dans l’expression. Notre étude a également suggéré que les mécanismes sous-jacents à l’acquisition de variations dans les transcrits Pax-6 par épissage alternatif ont été acquis uniquement dans la lignée des céphalopodes coléoïdes, car les mollusques inférieurs, tels que les bivalves, ne possèdent pas de fragment correspondant de type exon dans leurs génomes.

Fonction des variantes de squid Pax-6 et leur rôle putatif dans le développement oculaire

L’ajout et la délétion d’un fragment d’acide aminé codé dans les exons utilisés alternativement devraient provoquer des changements structurels dans les variantes de la protéine IpPax-6, ce qui pourrait modifier leur fonction dans le processus de développement. Deux de ses variantes (variantes 1 et 3) manquent d’un 153mer au milieu du Pax-6 authentique et de la moitié du HD (Figure 1). Pour explorer si la délétion influence leurs propriétés fonctionnelles, nous avons effectué des prédictions structurelles tridimensionnelles (3D) des protéines sur la base d’une modélisation comparative. Les structures 3D supposées du HDs de l’IpPax-6 authentique et la variante dépourvue du segment codé par l’exon 3 ont été construites. La structure du modèle a été identifiée sous forme liée à l’ADN afin que nous puissions prédire la structure d’IpPax-6 et le variant sous forme liée à l’ADN. La structure 3D présumée de la forme authentique a été raisonnablement bien modélisée; les résidus de noyau, à savoir Phe sur la boucle avant la première hélice de la HD, Leu sur la première hélice, Leu sur la deuxième hélice et Trp et Phe sur la troisième hélice de la structure modèle, ont été conservés et les trois hélices de la HD étaient apparemment serrées l’une dans l’autre (Figure 3C). Les résidus importants pour la liaison à l’ADN, à savoir deux résidus Arg au niveau du bras N-terminal et des résidus polaires à la surface de la troisième hélice, étaient situés raisonnablement près de l’interface ADN (Figure 3C, D). Cependant, la structure 3D présumée de la variante présentait un certain nombre de problèmes. Dans la structure modélisée, la perte de la région codée par l’exon 3, qui code la partie N-terminale de la première hélice, a été compensée par 15 résidus codés dans l’exon 2. Ainsi, les séquences d’acides aminés des formes authentiques et variantes ne différaient que dans la région contenant les 15 résidus du côté N-terminal. Cette différence, cependant, a considérablement augmenté l’énergie structurelle de la variante et a apparemment déstabilisé la structure globale. Cette instabilité peut résulter d’un manque de Phe sur la boucle avant la première hélice et de Leu sur la première hélice. Ces composants sont évidemment importants pour le garnissage des trois hélices. De plus, deux résidus Arg au niveau de la boucle N-terminale qui se lient aux bases d’ADN dans le sillon mineur sous la forme authentique manquaient dans la variante. Ces problèmes de stabilité et de liaison de l’ADN dans le variant suggèrent fortement que la MH du variant est instable et que le domaine a peu d’affinité de liaison pour l’ADN (Figures 3D et 3D’). L’absence d’une MH stable suggère en outre que les variants 1 et 3 ont des sites cibles d’ADN différents de ceux de l’IpPax-6 authentique chez les espèces de calmars.

Deux variantes (variantes 2 et 3) présentaient également une insertion de 120 mer dans le domaine PST (Figure 1). La séquence insérée s’est avérée spécifique au calmar (figure 2). Cette insertion peut modifier les activités de trans-activation du domaine PST. La variante 4 a montré une insertion unique (57 mer) entre le PD et le HD. Le programme Motif (http://www.genome.jp/tools/motif/) n’a trouvé aucun domaine ou signature connu dans la séquence insérée. Cette insertion allonge un lieur entre les domaines PD et HD.