shRNS versus siRNS
RNS interferencia (RNAi) egy biológiai folyamat, ahol RNS molekulák használják, hogy gátolják a génexpresszió. Jellemzően rövid RNS-molekulák jönnek létre, amelyek kiegészítik az endogén mRNS-t, és amikor a sejtekbe kerülnek, kötődnek a cél mRNS-hez. A rövid RNS-molekula kötődése a cél mRNS-hez funkcionálisan inaktiválja a cél mRNS-t, és néha a cél mRNS lebomlásához vezet.
történelmileg kétféle rövid RNS molekulát használtak az RNAi alkalmazásokban. A kis interferáló RNS (siRNS) jellemzően kettős szálú RNS molekulák, 20-25 nukleotid hosszúságúak. A sejtekbe történő transzfektáláskor az siRNS átmenetileg gátolja a cél mRNS-t, amíg azok a sejten belül is lebomlanak. A kis hajtű RNS-ek (shRNS) az RNS szekvenciái, jellemzően körülbelül 80 bázispár hosszúságúak, amelyek magukban foglalnak egy belső hibridizációs régiót, amely hajtűszerkezetet hoz létre. az shRNS molekulákat a sejten belül feldolgozzák, hogy siRNS-t képezzenek, ami viszont leüti a génexpressziót. Az shRNS előnye, hogy beépülhetnek plazmidvektorokba, és integrálhatók a genomi DNS-be a hosszabb távú vagy stabil expresszió érdekében, és ezáltal a cél mRNS hosszabb leütése.
az shRNS-t az Exportin 5, Dicer és a RISC/AGO2 komplex dolgozza fel a sejtben. Az shRNS lentivirális szállítása lehetővé teszi a célgén stabil expresszióját és állandó leütését. (A kép forrása: dan cojocari), a CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0) vagy GFDL http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html, A Wikimedia Commons-on keresztül)
A shRNS hatékony expressziója RNS polimeráz III Promoterekből
a kis RNS-eket, beleértve az shRNS-eket, endogén módon átírják RNS polimeráz III-val (Pol III). Ez különbözik a cDNS-ektől, amelyeket RNS-polimeráz II alkalmazásával írnak át. ezért az shRNS-ek magas expressziójának garantálása érdekében a Cellecta olyan promotereket használ, amelyek specifikusan kötik a Pol III-t, az U6-ot és a H1-et promoterek. Mind az U6, mind a H1 promoterek jól működnek az shRNAacross sok sejttípusban, összehasonlítva A Pol II promoterekkel, mint például a CMV és az EF1, amelyek kis méretük miatt nem fejezik ki olyan hatékonyan az shRNS-eket. Ezenkívül a shmir-ek kifejezésére használt Pol II-promoterek nem működnek a legtöbb sejttípusban, ahol az U6 és a H1 jól működik.
A Lentivirális Vektorok lehetővé teszik a célok állandó leütését
az shRNS stabilan integrálódik a gazdasejt genomjába. Ahogy a sejtek osztódnak, az shRNS átkerül a lánysejtekbe. A lentivirális Vektorok használata az shRNS-ek expressziójához állandó leütést biztosít anélkül, hogy a sejteket többször át kellene transzfektálni. Ha többet szeretne megtudni a lentivirális Vektorok működéséről, olvassa el a lentivirális vektorrendszer oldalunkat.
az shRNA tervezésének optimalizálása
a hatékony shRNS-ek megtervezése elengedhetetlen a hatékony RNAi knockdown szűréshez. Az optimális szekvencia kiválasztása mellett számos strukturális tényező befolyásolja az shRNS hatékonyságát. Ezenkívül az shRNA szár-hurok hajtűszerkezete problémákat vet fel a könyvtár építésében és erősítésében. Reprezentatív minőségű shRNA könyvtárak létrehozása, jelentős erőfeszítéseket tettünk a könyvtárainkban található shRNA betétek hatékonyságának optimalizálására. Kidolgoztunk egy házon belüli algoritmust a leghatékonyabb shRNS szekvenciák előrejelzésére, és ezt kombináljuk a validált szekvenciák közzétett adataival könyvtáraink összeállításakor. Az shRNA szerkezetét a könyvtárépítéshez is optimalizáltuk.
az shRNA szerkezeti variációinak nagyszabású hatékony teszteléséhez kifejlesztettünk egy nagy áteresztőképességű shRNA hatékonysági tesztelési technológiát, amely egy riporter teszten alapul. Korábban kimutatták, hogy egy reporter gén (mint például a GFP) egy 3′ fúzióval egy cDNS fragmenshez vagy egy rövid oligonukleotidhoz egy célgénből hatékonyan használható az siRNS és az shRNS konstrukciók hatékonyságának monitorozására ezzel a célgénnel szemben. Ezen eredmények alapján kifejlesztettünk egy lentivirális riporter vektort a funkcionális shRNS konstrukciók azonosítására (1.ábra). Saját fejlesztésű shRNA testing reporter vektorunk lehetővé teszi mind az shRNA sablon klónozását a H1 promoter után, mind a célszekvenciákat a GFP reporter 3′ végén. Amikor ezt a konstrukciót sejtekké alakítják át, a H1 promóter transzkripciója shRNS-t termel, míg a CMV promóter transzkripciója GFP-sense cél mRNS fúziós transzkripciót generál, amely riporterként használható a funkcionális shRNS-ek szűrésére.
a genomi DNS-be integrált shRNA-target lentiviral reporter konstrukció térképe és a GFP-target reporter leütésének mechanizmusa. A funkcionális shRNS-konstrukciókkal átalakított sejtek alacsony GFP mRNS-szinttel rendelkeznek, míg a nem funkcionális shRNS-ek magas szintű GFP mRNS-expressziót tesznek lehetővé.
az shRNA szerkezetének optimalizálása érdekében egy shRNA-célkönyvtárat építettünk az shRNA validációs vektorban 150 shrna-ra, mindegyik shRNA-t 40 különböző, az irodalomban leírt kivitelben építettük fel.
ezzel a 150×40-es vonalkódos shRNA-Célkönyvtárral transzdukált cho-TRex cellákban végeztük az RNAi-képernyőket, és mértük a reprezentációt (a könyvtárban és a transzdukált cellákban), valamint az egyes shRNS-konstrukciók leütési hatékonyságát. A szűrés néhány reprezentatív adatait az alábbiakban mutatjuk be.
a tíz legjobb tervet azok alapján választották ki, amelyek a legmagasabb cél-leütési aktivitással rendelkeznek, az azonos kialakítású összevont oligonukleotidok, valamint az azonos kialakítású shRNS-ek egyenlő ábrázolása az összevont rnai könyvtárakban. Három p53 shRNS leütési hatékonyságát, amelyek ezekkel a 10 legjobb tervvel készültek egy lentivirális vektorban, tovább elemeztük RT-PCR egér fibroblaszt sejtekké történő transzdukció után.