Endotelio
L’endotelio corneale costituisce lo strato più interno della cornea, separandolo dall’umore acqueo nella camera anteriore dell’occhio (Fig. 61.1). L’endotelio è costituito da un singolo strato (circa 4 µm) di cellule epiteliali squamose, che sono caratterizzate dall’espressione distinta di pompe ioniche come Na+/K+/ATPasi e proteine a giunzione stretta come ZO-1 (Tabella 61.1). Questo strato funge da barriera per mantenere il corretto stato di disidratazione corneale tramite un meccanismo di perdita della pompa .
La perdita o la disfunzione delle cellule endoteliali corneali (CECs) crea l’accumulo di liquidi in eccesso nella cornea, con conseguente gonfiore progressivo, disorganizzazione stromale, ridotta trasparenza e visione alterata . Le principali cause di perdita e disfunzione endoteliale corneale sono distrofia endoteliale, trauma/chirurgia o uveite anteriore cronica. La distrofia corneale endoteliale di Fuchs e la distrofia endoteliale ereditaria congenita sono tra le distrofie corneali endoteliali più comuni causate da mutazioni genetiche e potenziali fattori ambientali . Un’altra causa frequente di distrofia endoteliale, la cheratopatia bollosa pseudofakica, è indotta dal danno all’endotelio durante la chirurgia della cataratta. Il diabete e l’invecchiamento sono anche fattori di rischio significativi per la perdita endoteliale corneale.
A differenza delle cellule epiteliali che possono riparare per proliferazione, i CEC adulti hanno una capacità proliferativa limitata. Invece, le cellule endoteliali tendono a riparare scivolando verso l’area di lesione e l’allargamento delle cellule adiacenti. Sebbene questo meccanismo mantenga la barriera endoteliale corneale dopo l’infortunio, riduce anche la densità delle cellule endoteliali e altera la loro morfologia esagonale e la capacità di pompaggio. Quando la riduzione della densità cellulare raggiunge un intervallo di 500-1000 cellule / mm2 o meno, l’unica opzione terapeutica disponibile è il trapianto corneale parziale o completo . Attualmente, il trapianto di cornea per la perdita endoteliale rappresenta il 60% di tutti i trapianti di cornea eseguiti negli Stati Uniti .
Per superare le carenze di donatori di tessuto corneale sopra descritte, gli sforzi iniziali si sono concentrati sull’isolamento e sull’espansione ex vivo dei CECs primari. La prima cultura di successo dei CECS umani è stata riportata nel 1965 . Da allora, sono state sviluppate diverse modifiche nelle tecniche di isolamento, nei substrati della matrice extracellulare e nei terreni di coltura per superare la limitata capacità di propagazione delle cellule e la perdita del fenotipo CEC in coltura . Per esempio, Okumura et al. ha esaminato l’espressione di diverse isoforme di laminina nella cornea e ha identificato laminin-511 e 521 come le forme di laminina predominanti nel DM adulto . Usando queste due laminine come substrato per la coltura in vitro di CECs umani, sono riusciti a migliorare significativamente l’attaccamento, la sopravvivenza e l’espansione dei CECs . Altri gruppi hanno provato a coltivare CECS umani su DMS derivati da donatori umani come substrati. Il vantaggio di questo approccio è che imita l’ambiente corneale in vivo per ottenere una corretta manutenzione e crescita CEC . L’importanza della DM nel sostenere l’espansione della CEC è stata confermata anche da un recente studio condotto su un modello di lesione endoteliale corneale del coniglio. Attraverso questo, è stato dimostrato che l’assenza di DM ha compromesso la migrazione CEC nativa e la rigenerazione della cornea .
Nonostante i vantaggi, l’uso di scaffold complica la consegna nella cornea, richiedendo procedure chirurgiche elaborate. Un approccio molto più semplice sarebbe quello di fornire CECS in sospensione cellulare. L’iniezione di cellule in sospensione consentirebbe metodi di produzione più semplici e teoricamente meno invasivi . Tuttavia, questo approccio aumenta il rischio di rimozione delle cellule iniettate dal flusso di umore acqueo, limitando la sopravvivenza cellulare e l’attecchimento nella cornea. Due metodi sviluppati per migliorare la consegna delle sospensioni cellulari nell’endotelio corneale includono l’uso della consegna guidata dal campo magnetico e la coiniezione delle cellule con un inibitore della ROCCIA. Per la consegna delle cellule magnetiche, i CEC sono etichettati con particelle magnetiche e consegnati nella posizione appropriata sulla superficie corneale posteriore con l’aiuto di un magnete esterno . In un recente esempio, i CEC sono stati etichettati con nanoparticelle superparamagnetiche e iniettati nella camera oculare anteriore di conigli adulti con lesione CEC. Analogamente al CEC nativo, le cellule iniettate formavano un monostrato e ripristinavano la trasparenza corneale senza effetti avversi . In alternativa, Okumura et al. coiniezione usata di CECs con l’inibitore della ROCCIA Y27632 per migliorare la sopravvivenza e la proliferazione di CEC. Questo approccio ha comportato un migliore attecchimento delle cellule e un migliore recupero della trasparenza corneale in un modello di coniglio di lesione corneale . Questi effetti salutari sono stati confermati in un modello di scimmia di distrofia endoteliale corneale, portando all’inizio di studi clinici sull’uomo. Nel 2018 lo stesso gruppo ha riportato i risultati del trapianto di CECs, in combinazione con inibitore della ROCCIA, in 11 pazienti di cheratopatia bollosa; più dell ‘ 80% dei pazienti trattati ha mostrato recupero dello spessore corneale e miglioramento dell’acuità visiva 24 settimane dopo il trattamento . Questo studio ha fornito la prima evidenza clinica che il trapianto minimamente invasivo di CECs umani coltivati può essere utilizzato come una nuova opzione terapeutica per trattare la disfunzione endoteliale corneale. Allo stesso tempo, ha sollevato questioni riguardanti lo sviluppo futuro di questo approccio. Questi includono la necessità di determinare una fascia di età del donatore adatta per la produzione di CEC trapiantabili di alta qualità, il contributo meccanicistico dell’inibitore della ROCCIA ai risultati clinici, il dosaggio preciso delle cellule per bilanciare efficacia e sicurezza e lo sviluppo di un mezzo per tracciare il destino delle cellule consegnate dopo il trapianto . Inoltre, la limitata disponibilità di CEC donatori di alta qualità e la limitata capacità delle cellule di espandersi in vitro stanno mettendo in pausa alcune sfide significative per la traduzione clinica di questo approccio.
Per questo motivo, diversi gruppi hanno cercato di generare cellule simili a CEC da fonti di cellule staminali alternative, come MSC, cellule derivate dalla pelle, cellule stromali corneali e PSC . Questi studi hanno applicato la nostra attuale comprensione dello sviluppo embrionale di CECs isolando le popolazioni progenitrici CEC putative, come gli NCC, dalle cellule primarie e differenziandole a cellule simili a CEC più mature. Ad esempio, le cellule dello stroma corneale e i precursori derivati dalla pelle contenenti NCC sono stati isolati e coltivati in presenza di acido retinoico e inibitore GSK 3β (attivatore della via di segnalazione Wnt) per indurre cellule simili a CEC. Queste cellule hanno mostrato upregulation di Pitx2, un fattore di trascrizione chiave per lo sviluppo del segmento dell’occhio anteriore, così come upregulation dei marcatori CEC Atp1a1 e Cdh2. È importante sottolineare che le cellule esibivano caratteristiche funzionali dei CECs, come la funzione di pompa. Quando le cellule sono state trapiantate usando un foglio di collagene come vettore, hanno ripristinato la visione in un modello di coniglio di cheratopatia . Usando un approccio simile, Shen et al. precursori derivati dalla pelle differenziati mediante coculturazione con B4G12, una linea CEC umana immortalata. Entro 1 settimana dalla differenziazione, le cellule hanno mostrato una marcata espressione di marcatori CEC tipici. Il trapianto di queste cellule ha portato al successo del recupero dello spessore corneale e della trasparenza corneale sia nei modelli di coniglio che di scimmia della distrofia endoteliale corneale .
Gli NCC possono anche essere generati in vitro da PSC, offrendo una fonte illimitata ed espandibile di cellule per applicazioni cliniche. Zhang et al. ha riportato la differenziazione di ESCs umani a cellule precursori mesenchimali perioculari (POMPs), un sottotipo di NCCs, da coculture transwell con cellule stromali corneali umane. Queste POMPE indotte sono state coltivate in media condizionati da cellule epiteliali della lente e la differenziazione è stata confermata testando l’espressione genica di marcatori CEC tipici come N-Caderina, FoxC1 e PITX2. Per arricchire le cellule simili a CEC, le cellule sono state quindi ordinate e seminate su una matrice corneale suina decellularizzata seguita da trapianto di successo e induzione della riparazione corneale in un modello di coniglio di distrofia corneale .
Per evitare l’uso di materiale xenogenico da cornee decellularizzate, approcci recenti stanno impiegando composti di piccole molecole e fattori di crescita privi di xeno per indurre il destino delle cellule CEC. Diversi gruppi, ad esempio, hanno mostrato la differenziazione di PSCs a NCCs dopo l’inibizione della via TGFß/SMAD . Questi NCC sono stati quindi coltivati in supporti contenenti PDGF-BB e Dkk2, che hanno indotto le cellule ad acquisire l’aspetto esagonale e ad esprimere i marcatori molecolari delle cellule CEC . È importante sottolineare che le cellule potrebbero depositare collagene generando un DM generato in vitro ed espresso componenti principali della funzione di pompa endoteliale corneale come Na+K+ATPasea1 . Sebbene promettente, l’aspetto funzionale di queste cellule CEC derivate da PSC attende ulteriori indagini. Alcune domande future critiche includono la capacità di queste cellule CEC-like derivate da PSC di funzionare come una barriera che perde e mantenere lo stato di disidratazione della cornea, così come l’esplorazione del loro potenziale terapeutico in vivo.