Cinque Pax-6 varianti e il loro pattern di espressione del calamaro embrioni e adulti tessuti oculari
Abbiamo eseguito una singola 3’di CORSA di PCR per il pigmeo calamari Pax-6 gene (indicato come IpPax-6) per indagare le varianti di splicing e più loci di Pax-6 in coleoid cefalopodi. Abbiamo scoperto che non c’erano loci multipli nel calamaro pigmeo, ma abbiamo identificato tre varianti Pax-6 di lunghezze discrete. Le differenze nelle sequenze aminoacidiche tra queste varianti Pax – 6 sono state limitate a regioni limitate. Quindi, sono stati ipotizzati come il risultato di eventi di splicing alternativi di un singolo locus. Successivamente abbiamo convalidato la presenza di varianti di splicing utilizzando RT-PCR e abbiamo finalmente ottenuto cinque tipi di varianti di splicing, tra cui un ortologo apparente di Pax-6 autentico (Figura 1). La lunghezza e la struttura di authentic IpPax-6 erano simili a quelle dei geni Pax-6 trovati in altre specie di calamari, Euprymna scolopes e Loligo pealei15,16. Authentic IpPax-6 (authentic form, 499 aa) comprende due domini indipendenti di legame al DNA, i domini PD e HD e un dominio C-terminale P/S/T-rich (PST), che è l’attivatore dedicato con una proteina trans-attivatore partner, come mostrato in molti animali (Figura 1). Sia la somiglianza delle sequenze proteiche che l’albero filogenetico hanno confermato che IpPax-6 era un ortologo di fly ey e vertebrati Pax-4/6 (figura supplementare 1). Le quattro varianti identificate hanno prodotto proteine con lunghezze diverse da quelle dell’autentico IpPax-6 (Figura 1).
Diagrammi delle varianti di splicing presenti nel calamaro pigmeo.
La riga superiore mostra una struttura esone-introne stimata del gene squid Pax-6. La punta della freccia mostra un introne confermato nelle specie di calamari mediante analisi PCR genomica e in uno studio precedente. La forma autentica (499 aa) è la più abbondante ed è simile al gene Pax-6 di altre specie di calamari. Le varianti 1 e 3 mancano dell’esone 4 che codifica la metà N-terminale dell’HD. Le varianti 2 e 3 hanno un esone aggiuntivo, esone 6, nel dominio PST. La variante 4 mostra anche un esone 3 aggiuntivo che codifica 20 aminoacidi nella regione del linker tra i domini PD e HD.
Per esplorare l’espressione specifica dello stadio delle varianti squid Pax-6, abbiamo eseguito Q-PCR per vari tessuti e in vari stadi embrionali utilizzando primer progettati per indirizzare gli esoni aggiuntivi di IpPax-6 (Figura 2 & Figura S2). Le uova di calamaro mostrano gastrulazione epibolica e sviluppo diretto senza stadi larvali tipici dei mollusco17. Gli occhi embrionali appaiono dall’epiderma esterno del blastodisc e sono differenziabili dopo lo stadio 18, con pigmentazione retinica a partire dallo stadio 20. La lente appare come una struttura trasparente simile a un bastone visibile ad occhio nudo allo stadio 25. Per prima cosa abbiamo eseguito Q-PCR utilizzando primer mirati a exon 2, che copre tutte e cinque le varianti. L’analisi Q-PCR ha mostrato che IpPax-6 è stato espresso allo stadio 16 prima della formazione della vescicola oculare (Figura 2A). L’intensità di espressione di IpPax-6 è stata gradualmente aumentata con lo sviluppo dell’embrione di calamaro (Figura 2A), con il bulbo oculare che mostra le più alte intensità di espressione tra i tessuti testati. Come osservato negli altri animali bilateriani, le forme autentiche e varianti di IpPax-6 sono state espresse a livelli marcatamente depressi nel tessuto muscolare. Abbiamo quindi utilizzato primer per le varianti prive di esone 4 (varianti 1 e 3, Figura 2B). I primer hanno rilevato le varianti 1 e 3 a bassi livelli negli embrioni allo stadio 16 e nel tessuto del bulbo oculare. Abbiamo anche utilizzato primer per il targeting di varianti tra cui exon 6 (varianti 2 e 3, Figura 2C). L’analisi Q-PCR ha mostrato che le varianti 2 e 3 sono state espresse nei bulbi oculari e nei lobi ottici, nonché negli embrioni negli stadi 16 e 25. Poiché la formazione delle cellule fotorecettrici e della lente inizia negli embrioni allo stadio 25, le varianti tra cui l’esone 6 possono contribuire allo sviluppo dell’occhio. I risultati dimostrano che i modelli di espressione delle varianti IpPax-6 differivano significativamente da quelli di authentic IpPax-6.
Espressione delle varianti pygmy squid Pax-6.
I livelli di espressione di tutte le varianti IpPax-6 (A), varianti senza esone 4 (varianti 1 e 3) (B) e varianti compreso l’esone 6 (varianti 2 e 3) (C) sono stati quantificati mediante analisi RT-PCR in tempo reale. Il livello di espressione in ciascuna parte del corpo rispetto allo stadio 16 (1.0) è stato calcolato e successivamente normalizzato al livello di espressione di alfa-tubulina. Le quantificazioni sono state eseguite due volte su diversi CDNA generati in modo indipendente e sono stati calcolati i mezzi geometrici. L’asse y è arbitrario. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard. (D-G) Analisi di ibridazione in situ a monte intero con sonde anti-senso RNA per IpPax-6 esone 2 (D, F) e IpPax-6 esone 4 (E, G). Una sonda a RNA progettata dall’esone 2 che ha preso di mira tutte e cinque le varianti ha mostrato l’espressione di Pax-6 attraverso l’area cerebrale degli embrioni allo stadio 22 (D) e allo stadio 25 (F). La sonda RNA progettata da exon 2 indica anche l’espressione Pax-6 intorno agli occhi (D’, vista laterale). Una sonda a RNA progettata dall’esone 4 che mira intrinsecamente alle varianti e alle forme di variante 2 e 4 ha mostrato modelli di espressione simili (E, G) a quello della sonda che mira all’esone 2, tranne nel tessuto intorno agli occhi (E). Questo risultato suggerisce che le varianti con una delezione dell’esone 4 (varianti 1 e 3) mostrano una localizzazione specifica nel tessuto intorno agli occhi rispetto alle altre varianti (punta di freccia). Barre di scala, 10 µm.
Per distinguere quali varianti sono presenti in ogni fase, abbiamo eseguito RT-PCR utilizzando set di primer attraverso i confini degli esoni. La variante 1 è stata considerata espressa in tutti / alcuni stadi embrionali ma non negli occhi adulti (figura supplementare 2). L’analisi RT-PCR ha anche mostrato che la variante 4 era fortemente espressa negli occhi adulti, in particolare nella retina, ma non nelle lenti (figura supplementare 2A). Le varianti 2 e 3 sono state espresse in tutti gli stadi embrionali e anche nei tessuti adulti (figura supplementare 2B).
Per identificare l’espressione tissutale-specifica delle varianti IpPax-6, abbiamo eseguito l’ibridazione in situ utilizzando sonde a RNA progettate per legarsi specificamente a ciascuna variante (Figura 2D–G). La sonda RNA progettata da exon 2 si rivolge a tutte e cinque le varianti identificate in questo studio. La sonda RNA progettata dall’esone 4 legata alla forma autentica e alle varianti 2 e 4. IpPax – 6 è stato trovato per essere localizzato nella zona del cervello, compreso il lobo basale dorsale, lobo frontale superiore, peduncolo/lobi olfattivi e lobi ottici (Figura 2D–G), come descritto in Hartmann et al.18 Anche il tessuto esterno alla retina (forse corrispondente al futuro strato iridoforo) esprimeva chiaramente IpPax-6 allo stadio 22 (Figure 2D e 2D’). L’espressione di IpPax-6 è stata osservata in questo strato fino allo stadio 25. L’ibridazione in situ che utilizza la sonda mirata all’esone 4 ha suggerito che le varianti 2 e 4 avevano modelli di espressione simili nel cervello ma non negli occhi (Figura 2E). Questo risultato suggerisce che le varianti 1 e 3 (prive dell’esone 4) sono sovraregolate nello strato esterno degli occhi. Queste conseguenze implicano che ogni variante IpPax – 6 è regolata indipendentemente attraverso i processi di formazione degli occhi.
Struttura esone-introne di Pax-6 in altri cefalopodi/molluschi
Abbiamo studiato se questo tipo di splicing alternativo è stato acquisito solo nei cefalopodi coleoidi. Applicando l’analisi RT-PCR agli RNA embrionali del calamaro di lancia giapponese (Loligo bleekeri), abbiamo trovato tre tipi di MRNA possibilmente derivati dallo splicing alternativo (salto dell’esone 4, inserimento dell’esone 3 e inserimento dell’esone 6) negli occhi (Figura 3A, B). Gli esoni inseriti 3 e 6 codificavano rispettivamente 20 e 40 aminoacidi, mentre l’esone saltato 4 codificava 51 aminoacidi. Per rilevare la presenza di splicing alternativo simile in altri genomi di molluschi, abbiamo esaminato le strutture esone-introne di Pax-6 nel limpet gufo e pearl oyster. La sequenza genomica completa del limpet gufo (Lottia gigantea, ottenuto da JGI genome portal Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 e della pearl oyster (Pinctada fucata, ottenuto dalla OIST Marine Genomics Unit genome browser P. fucata_ver1.0, trascrizione: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, scaffold8418.1) 20 ha mostrato che il mollusco Pax-6 ha cinque esoni. L’esone 4 nel calamaro è stato conservato in tutte le specie di molluschi testate. Tuttavia, gli esoni 3 e 5 non sono stati trovati nel gene pearl oyster Pax-6. Così, abbiamo scoperto che le forme varianti 2 e 4 sono state acquisite nel lignaggio dei cefalopodi coleoidi (Figura 1).
Indel trovati nelle varianti IpPax-6 e strutture 3D previste dell’HD.
Sequenze nucleotidiche allineate di (A) esone 3 e (B) esone 6 del calamaro pigmeo e del calamaro lancia giapponese, rispettivamente. Allineamento delle sequenze aminoacidiche tradotte della MH utilizzate nella modellazione comparativa (C). Le varianti 1 e 3 di IpPax-6 mancano di una parte di helix 1. La struttura tridimensionale dell’HD giuntato ottenuta mediante modellazione omologica (D, D’). Bastoncini verdi indicano proteine di IpPax – 6 e sfere grigie rappresentano molecole di DNA bersaglio. Il cerchio tratteggiato indica la parte dell’elica 1 persa dalla cancellazione dell’esone 4.
Per quanto ne sappiamo, il nostro studio è il primo a riportare varianti di splicing in-frame di squid Pax-6 che sono state espresse in modo diverso a seconda dello stadio embrionale. Studi precedenti hanno isolato tipi discreti di varianti di splicing che avevano perso la metà N-terminale del dominio PD in altre specie di calamari15, 18, ma queste varianti non mostravano differenze spazio-temporali nell’espressione. Il nostro studio ha anche suggerito che i meccanismi alla base dell’acquisizione di variazioni nei trascritti Pax-6 mediante splicing alternativo sono stati acquisiti in modo univoco nel lignaggio dei cefalopodi coleoidi, poiché i molluschi inferiori, come i bivalvi, non possiedono un corrispondente frammento simile all’esone nei loro genomi.
Funzione delle varianti squid Pax-6 e il loro ruolo putativo nello sviluppo dell’occhio
Si prevede che l’aggiunta e la delezione di un frammento di aminoacido codificato negli esoni usati in alternativa causino cambiamenti strutturali nelle varianti proteiche IpPax-6, che possono alterare la loro funzione nel processo di sviluppo. Due delle sue varianti (varianti 1 e 3) mancano di un 153mer nel mezzo dell’autentico Pax-6 e metà dell’HD (Figura 1). Per esplorare se la delezione influenza le loro proprietà funzionali, abbiamo eseguito previsioni strutturali tridimensionali (3D) delle proteine basate su modelli comparativi. Sono state costruite le presunte strutture 3D dell’HDs di authentic IpPax-6 e la variante priva del segmento codificato da exon 3. La struttura del modello è stata identificata dalla forma legata al DNA in modo da poter prevedere la struttura di IpPax-6 e la variante in forma legata al DNA. La presunta struttura 3D della forma autentica è stata ragionevolmente ben modellata; i residui del nucleo, vale a dire Phe sull’anello prima della prima elica dell’HD, Leu sulla prima elica, Leu sulla seconda elica e Trp e Phe sulla terza elica della struttura modello, sono stati conservati e le tre eliche dell’HD erano apparentemente strettamente imballate l’una nell’altra (Figura 3C). I residui importanti per il legame del DNA, vale a dire due residui Arg sul braccio N-terminale e residui polari sulla superficie della terza elica, erano situati ragionevolmente vicino all’interfaccia del DNA (Figura 3C, D). Tuttavia, la presunta struttura 3D della variante presentava una serie di problemi. Nella struttura modellata, la perdita della regione codificata dall’esone 3, che codifica la parte N-terminale della prima elica, è stata compensata da 15 residui codificati nell’esone 2. Pertanto, le sequenze amminoacidiche delle forme autentiche e varianti differivano solo nella regione contenente i residui 15 del lato N-terminale. Questa differenza, tuttavia, ha aumentato significativamente l’energia strutturale della variante e apparentemente destabilizzato la struttura complessiva. Questa instabilità può derivare dalla mancanza del Phe sul circuito prima della prima elica e del Leu sulla prima elica. Questi componenti sono evidentemente importanti per il confezionamento delle tre eliche. Inoltre, due residui di Arg nell’anello N-terminale che si legano alle basi del DNA nella scanalatura minore nella forma autentica mancavano nella variante. Questi problemi di stabilità e legame del DNA nella variante suggeriscono fortemente che l’HD della variante è instabile e che il dominio ha poca affinità di legame per il DNA (Figure 3D e 3D’). La mancanza di una MH stabile suggerisce inoltre che le varianti 1 e 3 hanno diversi siti bersaglio del DNA da quello dell’autentico IpPax-6 nelle specie di calamari.
Due varianti (varianti 2 e 3) hanno anche mostrato un inserimento di 120 mer all’interno del dominio PST (Figura 1). La sequenza inserita è risultata essere specifica per squid (Figura 2). Questo inserimento potrebbe modificare le attività di trans-attivazione del dominio PST. La variante 4 mostrava un inserimento unico (57 mer) tra PD e HD. Il programma Motif (http://www.genome.jp/tools/motif/) non ha trovato domini o firme noti nella sequenza inserita. Questo inserimento allunga un linker tra i domini PD e HD.