Abstract
l’Eufrasia, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), è una pianta medicinale utilizzata tradizionalmente in Europa per il trattamento di vari disturbi di salute, soprattutto come collirio per il trattamento di malattie degli occhi come la congiuntivite e blefarite che possono essere associati con le infezioni batteriche. Alcune specie di Euphrasia sono state precedentemente segnalate per contenere olio essenziale. Tuttavia, la composizione e la bioattività dell’olio di E. rostkoviana sono sconosciute. Pertanto, in questo studio, abbiamo studiato la composizione chimica e l’attività antimicrobica dell’olio essenziale di eufrasia contro alcuni organismi associati a infezioni oculari: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. L’analisi GC-MS ha rivelato più di 70 costituenti, con acido n-esadecanoico (18,47%) come costituente principale seguito da timolo (7,97%), acido miristico (4,71%), linalolo (4,65%) e anetolo (4,09%). L’olio essenziale ha mostrato un effetto antimicrobico contro tutti gli organismi testati ad eccezione di P. aeruginosa. La migliore attività è stata osservata contro tutti i batteri Gram-positivi testati con concentrazioni inibitorie minime di 512 µg / mL. Questo è il primo rapporto sulla composizione chimica dell’olio essenziale di E. rostkoviana e sulla sua attività antimicrobica.
1. Introduzione
L’eufrasia, Eufrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), è stata utilizzata in Europa per secoli come medicina tradizionale per il trattamento di varie malattie. Decotti e infusi di parti aeree fiorite sono usati contro tosse secca, raucedine, trattamento sintomatico del raffreddore, mal d’orecchi e mal di testa, febbre da fieno, lesioni cutanee purulente o malattie catarrali del tratto intestinale, ma soprattutto come collirio per trattare e prevenire disturbi oculari come congiuntivite, blefarite, affaticamento degli occhi, infiammazione oculare purulenta e porcili . L’uso del tè dell’eufrasia inoltre è stato riferito in medicina ethnoveterinary per il trattamento dell’infezione dell’occhio della mucca . Nonostante secoli di uso tradizionale per il trattamento dei disturbi oculari, è stato effettuato un solo studio prospettico di coorte che conferma l’efficacia del collirio Euphrasia nel trattamento della congiuntivite e un singolo studio clinico che studia l’effetto dell’applicazione locale del collirio sul consumo di antibiotici nei neonati . Inoltre, fino alle recenti relazioni sull’attività anticandidale e antibatterica di alcuni estratti di Eufrasia, lo spettro dell’azione antimicrobica è stato completamente sconosciuto.
L’effetto terapeutico di E. rostkoviana può essere attribuito principalmente alla sua attività antiossidante, antinfiammatoria e antimicrobica . Tra i composti precedentemente identificati negli estratti di E. rostkoviana, apigenina, luteolina, kaempferolo, quercetina, acido caffeico, acido cumarico e acido rosmarinico possono essere responsabili dell’azione antimicrobica. Sebbene sia stata precedentemente riportata la presenza di olio essenziale (EO) in E. officinalis L. ed E. stricta Kunt, la composizione e la bioattività dell’E. rostkoviana EO sono sconosciute. Pertanto, in questo studio, abbiamo studiato la composizione chimica e l’attività antimicrobica dell’eufrasia EO contro il pannello di tre batteri Gram-positivi (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus e S. epidermidis) e tre batteri Gram-negativi (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa), e uno di lievito (Candida albicans), organismi comunemente associati con infezioni agli occhi.
2. Materiale e metodi
2.1. Prodotti chimici e Materiale Vegetale
L’autentica di norme borneolo, canfora, carvacrolo, carvone, cariofillene, p-cimene, estragolo, eucaliptolo, limonene, linalool, mentolo, mentone, β-myrcene, γ-terpinene, e timolo per EO componenti di identificazione così come il controllo antibiotici ciprofloxacina e tioconazolo sono stati acquistati dalla Sigma-Aldrich (Praga, Repubblica ceca). Esano (Merck, Praga, Repubblica Ceca), dimetilsolfossido (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Repubblica Ceca) e Tween 80 (Sigma-Aldrich, Praga, Repubblica Ceca) sono stati usati come solventi. Il materiale vegetale utilizzato per la distillazione EO è stato acquistato da fonti commerciali (F-DENTAL, Hodonín, Repubblica Ceca). L’EO è stato estratto per idrodistillazione utilizzando apparecchi di tipo Clevenger.
2.2. Analisi chimica dell’EO mediante Gascromatografia-Spettrometria di massa (GC-MS)
L’EO E. rostkoviana è stato analizzato da GC-MS utilizzando Agilent 7890A GC accoppiato a un rilevatore di massa a quadrupolo singolo Agilent 5975C dotato di una colonna HP-5MS (pellicola 30 m × 0,25 mm, 0,25 µm) di Agilent (Santa Clara, CA, USA). L’esano è stato utilizzato come solvente e il volume del campione di 1 µL è stato iniettato in modalità split (rapporto 20 : 1) nell’iniettore riscaldato a 250°C. La temperatura del forno di partenza è stata impostata a 60°C per 3 min, programmata a 230°C ad una velocità di 3°C/min, e quindi mantenuta costante per 10 L’elio è stato utilizzato come gas vettore con una portata di 1 mL / min. L’analisi MS è stata effettuata in modalità full-scan e l’energia di ionizzazione degli elettroni è stata impostata a 70 eV. L’identificazione dei singoli componenti si è basata sul confronto dei loro spettri di massa e relativi indici di ritenzione con il National Institute of Standards and Technology Library (NIST, USA) e la letteratura , così come la coiniezione di standard autentici.
2.3. Ceppi batterici e mezzi di coltivazione
I ceppi standard di tre batteri gram-positivi Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, e S. epidermidis ATCC 12228, tre batteri Gram-negativi Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e un lievito Candida albicans ATCC 10231 sono stati ottenuti da Oxoid (Basingstoke, Regno Unito). Il brodo di Mueller-Hinton aggiustato per cationi (MHB) e il brodo di destrosio Sabouraud (SDB) sono stati utilizzati rispettivamente come terreno di coltivazione per il test di microdiluzione antibatterica e antifungina e sono stati equilibrati con soluzione salina tamponata con Tris (Sigma-Aldrich, Praga, Repubblica Ceca). Mueller-Hinton agar (MHA) e Sabouraud destrosio agar (SDA) sono stati utilizzati per la successiva determinazione delle concentrazioni battericida e fungicida, rispettivamente. Tutti i supporti sono stati acquistati da Oxoid (Basingstoke, Regno Unito).
2.4. Determinazione della concentrazione minima inibitoria (MIC)
I MIC sono stati determinati utilizzando il metodo di microdiluizione del brodo in vitro seguendo le linee guida del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) modificato in base alle raccomandazioni proposte per una valutazione efficace del potenziale anti-infettivo dei prodotti naturali utilizzando piastre di microtitolazione a 96 pozzetti. In breve, l’EO è stato sciolto in DMSO con aggiunta di Tween 80 e due volte diluizioni seriali sono state preparate in MHB per i batteri e in SDB per il lievito, mentre le concentrazioni testate variavano da 4 a 2048 µg/mL. L’inoculo è stato preparato da colture notturne in modo che le concentrazioni iniziali di CFU nelle micropiastre fossero rispettivamente di 5 × 105 e 2 × 103 CFU/mL per batteri e lieviti. Le piastre inoculate sono state esaminate dopo 24 ore di incubazione a 35°C e ancora una volta dopo 48 h in caso di C. albicans. La crescita microbica è stata misurata spettrofotometricamente dal fotometro Multiscan Ascent Microplate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) a 405 nm. Le MIC sono state espresse come le concentrazioni più basse in grado di inibire ≥ 80% della crescita batterica rispetto al controllo positivo della crescita. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia in tre test indipendenti e valori mediani sono stati utilizzati per il calcolo MICs. A causa della possibilità recentemente riportata di influenza dei componenti volatili EO sulla crescita microbica nei pozzetti adiacenti, sono state inserite righe di controllo della crescita positive tra le righe di diluizione EO per rilevare l’eventuale influenza della crescita. I solventi utilizzati non hanno inibito la crescita batterica alle concentrazioni testate. Ciprofloxacina e tioconazolo sono stati utilizzati come antibiotici di riferimento per batteri e lieviti, rispettivamente.
2.5. Concentrazione battericida minima (MBC) e Concentrazione fungicida minima(MFC) Determinazione
Le aliquote di 20 µL sono state trasferite da ciascun pozzetto senza crescita microbica alle piastre MHA (piastre SDA per C. albicans) dopo 24 h e 48 h di incubazione di batteri e lieviti testati, rispettivamente. Le piastre sono state quindi incubate per 24 ore a 35°C. MBC e MFC sono stati valutati come diminuzione ≥99,9% di CFU rispetto all’inoculo, tutti eseguiti in triplice copia in tre test indipendenti.
3. Risultati e discussione
3.1. Caratterizzazione chimica di oli e frazioni bioattive Costituenti
L’idrodistillazione EO da parte dell’apparecchio di tipo Clevenger ha prodotto lo 0,02% (p/v) di olio bruno-giallastro che tende a solidificare a temperatura ambiente, probabilmente causata da un’alta percentuale di acidi grassi (32,23% in totale). L’analisi GC-MS dell’EO ha rivelato la presenza di oltre 70 costituenti, con l’acido palmitico (18,47%) che è il componente più abbondante seguito da timolo (7,97%), acido miristico (4,71%), linalolo (4,65%), anetolo (4,09%), acido linolenico (3,81%), esaidrofarnesil acetone (3,16%), acido laurico (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.
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| R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identificazione basata sulla coiniezione del campione autentico; d: identificazione provvisoria. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
L’alto contenuto di acidi grassi è stato precedentemente riscontrato nell’E. stricta EO (25,7% in totale) anche con la più alta percentuale di acido palmitico (20,3%) e acido miristico (3,9%) . Tuttavia, non c’è nessun altro composto presente in quantità significativa che indicherebbe la parentela di queste due specie di Euphrasia.
3.2. Attività antimicrobica
La E. rostkoviana EO ha mostrato attività contro sei su sette organismi testati con MICROFONI che vanno da 512 a 2048 µg / mL. I batteri Gram-positivi erano più sensibili di quelli Gram-negativi e del lievito, mentre P. aeruginosa era l’unico organismo che non era inibito dall’olio alle più alte concentrazioni testate. I MICROFONI, MBC e MFC dell’EO contro tutti i microrganismi testati sono riassunti nella tabella 2. Le concentrazioni attive sono paragonabili a quelle precedentemente riportate per, ad esempio, EOs di Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum o Thymus vulgaris, specialmente nel caso di attività anticandidale . L’olio era anche più efficace degli estratti di E. rostkoviana testati da Teixeira e Silva contro E. coli, E. faecalis, S. aureus e S. epidermidis. I MIC degli antibiotici di riferimento contro i batteri e il lievito sensibili alla E. rostkoviana EO erano in conformità con i limiti accettabili CLSI e precedenti relazioni, rispettivamente .
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| The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poiché il contenuto del principale costituente di EO acido palmitico non supera il 20% e ci sono più di 10 altri composti antimicrobici attivi che vanno dall ‘1 all’ 8% è difficile suggerire i principali agenti responsabili dell’effetto antimicrobico EO di E. rostkoviana. L’acido palmitico è stato precedentemente identificato come il principale composto di frazioni attive contro i batteri Gram-negativi, ma non Gram-positivi . D’altra parte, gli acidi grassi saturi a catena media e gli acidi grassi insaturi a catena lunga sono noti per inibire i batteri particolarmente Gram-positivi . Inoltre, l’acido laurico esercita anche attività contro un certo numero di funghi . Pertanto l’attività antimicrobica dell’EO è probabilmente dovuta ad un’azione complessa degli acidi grassi antimicrobici con gli altri composti antimicrobici ben noti identificati nell’EO come anetolo, borneolo, canfora, carvacrolo, linalolo, mentolo, α-terpineolo o timolo.
4. Conclusioni
In conclusione, l’analisi chimica ha rivelato una serie di sostanze antimicrobicamente attive presenti nell’E. rostkoviana EO e la sua attività antifungina e antibatterica contro i batteri Gram-positivi e Gram-negativi è stata confermata. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo rapporto sulla composizione e l’attività antimicrobica di E. rostkoviana EO.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.
Riconoscimenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Fondazione Europea della Scienza e dal Ministero dell’Istruzione, della Gioventù e dello Sport del Progetto CZ della Repubblica Ceca.1.07/2.3.00/30.0040; dalla S-grant del Ministero dell’Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca; e dal progetto IGA 20155012 dell’Università ceca di Scienze della Vita di Praga. Gli autori sono grati a Slavka Barlakova per la correzione di bozze in inglese.