Effetto citopatico (CPE): come fanno i virus a farla franca con l’omicidio

I virus, per definizione, sono invisibili ai nostri occhi. Sono nanostrutture che possono diventare visibili solo usando la microscopia elettronica, una tecnica che richiede molto tempo e non è accessibile a tutti. Di conseguenza, un virologo deve trovare alternative per poter lavorare e studiare il suo oggetto di interesse. Un modo pratico di” vedere ” e misurare indirettamente un’infezione virale è guardando il danno che un virus causa a una cellula. Questa sofferenza o danno è noto come effetto citofatico (CPE) e la sua misura è ampiamente usato nei laboratori di virologia in tutto il mondo.

CPE è un approccio molto semplice per capire come un virus infetta una cellula, ma questo non significa che sia solo usato nella ricerca scientifica di base. Misurazione CPEs può anche essere una lettura molto utile per le aziende farmaceutiche e laboratori diagnostici.

Qual è l’effetto citofatico indotto dal virus?

I virus sono parassiti che hanno bisogno di una cellula ospite per replicarsi. Una volta all’interno della cellula, dirottano il macchinario cellulare per produrre le proprie proteine, acido nucleico e membrana (quando necessario).

Poiché il virus occupa fattori cellulari che sono altrimenti utilizzati dalla cellula, la sua replicazione può alterare le funzioni di base delle cellule ospiti o addirittura distruggerlo. L’insieme di cambiamenti cellulari o alterazioni derivanti da un’infezione virale sono noti come CPEs. Questi sono solitamente cambiamenti negativi che possono causare modifiche strutturali, metaboliche o funzionali nella cellula che viene infettata. Nel tempo, la CPE può dare origine agli effetti patologici del virus (la malattia).

Esempi classici dell’effetto citopatico

Un noto CPE indotto da virus è la morte cellulare (guarda un video di una cellula morente in ). Molti virus uccidono le cellule per lisi o inducendo l’apoptosi. Ad esempio, l’HIV è noto per l’uccisione di linfociti T CD4+, che è il motivo principale per cui gli individui infetti diventano immunocompromessi.

In laboratorio, un modo semplice per uccidere una linea cellulare di zanzara (come C6/36) o cellule Vero è infettandolo con qualsiasi famoso arbovirus, come Chikungunya, Dengue o Zika. Dopo alcuni giorni di infezione le cellule cadono a pezzi proprio davanti ai tuoi occhi (Fig. 1).

Figura 1 / Le cellule Vero sono state infettate dal virus Zika. Dopo 72 ore di infezione, un chiaro CPE è evidente dalla presenza di debri cellulari a seguito della morte cellulare.

Un altro esempio di CPE è syncytia formation. Le cellule infettate da virus avvolti esprimono proteine virali sulla loro membrana plasmatica, che vengono utilizzate dai virus per mediare la fusione con la cellula ospite. Quando queste proteine virali si legano ai recettori sulla superficie delle cellule vicine, avviene la fusione cellula-cellula, con conseguente formazione di sincitia (cellula gigante multinucleata).

Il virus respiratorio sinciziale (RSV) è la principale causa di polmonite virale nei bambini piccoli. Il suo nome deriva dal fatto che può formare syncytia in coltura cellulare ma, notevolmente, anche nei polmoni dei pazienti infetti.

I cambiamenti correlati al CPE nella morfologia cellulare includono anche l’arrotondamento, il distacco e / o l’aggregazione delle cellule aderenti. In questo caso, le cellule infette rimangono metabolicamente attive per replicare il virus, ma il loro citoscheletro è alterato. I cambiamenti morfologici possono essere spiegati da una down-regolazione dell’espressione delle proteine di adesione superficiale a seguito di infezione. Il virus Ebola, ad esempio, è noto per causare cambiamenti morfologici drammatici nelle cellule aderenti diminuendo l’espressione dell’integrina β1.

Hai davvero bisogno di tanto dramma (morte, gigantismo, deformazione) per essere considerato un CPE? No. Le cellule possono semplicemente “comportarsi” in modo diverso quando sono infette, ma hanno lo stesso aspetto. Più sottile ma ancora chiaro CPE-tipo di cambiamenti possono includere alterazione del tasso di crescita / cinetica, cambiamenti in una data attività metabolica, o cambiamenti nella funzione cellulare. Tra i diversi virus che possono indurre questi tipi di CPEs stand Zika virus. Nel 2015, questo virus trasmesso dalle zanzare era su tutte le notizie perché causa la microcefalia, un grave danno neurologico caratterizzato da una ridotta dimensione del cervello nei feti. Successivamente è stato descritto che la microcefalia è il risultato di diversi effetti citopatici indotti da Zika sulle cellule neurali, tra cui ipertrofia cellulare, restrizione della crescita, disregolazione del ciclo cellulare e morte cellulare. Un test di formazione di colonie è stato utilizzato, ad esempio, per identificare quali delle diverse proteine Zika interferiscono con la proliferazione cellulare.

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Gli effetti citopatici sono il risultato delle interazioni virus-ospite

È importante ricordare che il CPE non è definito solo dal virus, ma anche dalla cellula ospite. Dipende da quanto permissive le cellule sono alle infezioni. Essere una cellula permissiva, in grado di supportare la crescita di un virus. In altre parole, non tutti i virus possono infettare tutti i tipi di cellule. Per semplificare, possiamo dire che:

• Non permissive cell – Virus non può infettare
• Permissive cell – Virus può replicare, ma non causa CPE ovvio
• Altamente permissive cell – Virus replica e induce un ovvio CPE

Quindi se aggiungi virus alle tue cellule e non succede nulla, non preoccuparti. Hai solo bisogno di trovare la giusta combinazione virus-cellule.

Letture – Come misurare CPE?

Cambiamenti cellulari indotti da virus come la morte cellulare o una morfologia alterata sono visibili al microscopio ottico. Puoi semplicemente mettere il tuo piatto sotto un microscopio invertito standard e vedere se le tue cellule sono morte o in qualche modo cambiate. Un aspetto positivo di questo approccio è che è “facile” perché non richiede alcuna elaborazione del campione, che evita artefatti di fissazione o colorazione.

Al ribasso, è qualitativo e non quantitativo, e si basa pesantemente sulla formazione dell’osservatore. Al giorno d’oggi, questo approccio può essere automatizzato facendo il monitoraggio in tempo reale della citopatogenesi indotta da virus. Ad esempio, le alterazioni virali della diffusione e della proliferazione cellulare possono essere valutate attraverso un test di guarigione delle ferite, in cui è possibile rilevare una ridotta velocità di migrazione collettiva e singola cellula insieme a gravi cambiamenti nella morfologia cellulare. Un altro approccio quantitativo è il monitoraggio della proliferazione cellulare mediante analisi automatizzata delle immagini. Con questa tecnologia è possibile generare curve di crescita di infetti vs. colture cellulari non infette per quantificare correttamente l’effetto citopatico che un’infezione da virus può avere.

Se le cellule morte sono ciò che rende la tua giornata, un’alternativa è il famoso test della placca. Questa tecnica di virologia classica viene utilizzata per quantificare le particelle virali infettive e si basa sul principio che i virus possono indurre la lisi cellulare. Dopo aver infettato un monostrato di cellule altamente permissive, le cellule sono contrastate con viola cristallino (le cellule viventi sono colorate, le cellule morte rimangono non colorate), con conseguente belle placche (aree di cellule morte) che possono essere facilmente quantificate ad occhio nudo.

Ma non devi vedere le tue cellule per sapere che sono morte. La vitalità cellulare post-infezione può essere misurata quantificando la concentrazione intracellulare di ATP con lucciola luciferasi o con il tradizionale test MTT.

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Applicazioni

Il tuo virus sta inducendo un CPE? Si può chiaramente vedere o misurare? Forte! È possibile utilizzare questo CPE come lettura di un’infezione virale di successo o la replica. Un dato CPE può servire come indicatore per scoprire come prevenire un’infezione, per caratterizzare i fattori ospiti o patogeni necessari per un’infezione, per identificare il tropismo del virus, tra gli altri. In termini pratici, ciò significa che può essere utilizzato come lettura per:

• Screening e valutazione del composto antivirale
  Un candidato di farmaci può prevenire la formazione di CPE?
• Screening per anticorpi neutralizzanti
  Un determinato anticorpo può inibire la CPE indotta dal virus?
• Sorveglianza della resistenza ai farmaci antivirali (fenotipizzazione)
  Un determinato virus isolato può indurre CPE in presenza di farmaci antivirali?
• Caratterizzazione del tropismo virale
  Quali tipi di cellule sono preferenzialmente infettati da un virus? Perché? (Controllare una recente pubblicazione con il famigerato SARS-CoV-2 in .)
• Diagnosi di malattie virali
  Un virus infetta attivamente una persona? Il campione clinico prelevato da quella persona induce CPE? Teniamo presente che la maggior parte dei metodi diagnostici (ELISA, RT-qPCR) non rileva particelle virali infettive.

Per concludere

Sebbene ci siano diversi modi per misurare l’infezione da virus, il controllo della CPE nelle cellule permissive rimane un’alternativa ampiamente utilizzata. Perché sia davvero utile, devi trovare la giusta combinazione: un virus, una cellula permissiva e una lettura accurata. Una volta trovata questa combinazione, le applicazioni possono essere molto diverse e utili sia in un ambiente accademico, nell’industria, o nella diagnostica clinica.

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