HPV/p16 positivi e negativi HNSCC mostrare le differenze nel coinvolgimento linfonodale
Abbiamo determinato l’HPV e p16 stato di 241 orofaringea carcinoma a cellule squamose (OPC) i pazienti trattati con (chemio)radiazione (c)RT. I campioni di tumore umano sono stati acquisiti secondo i protocolli approvati dal comitato etico degli Ospedali universitari di Lovanio (Lovanio, Belgio) e sono stati ottenuti il consenso implicito di tutti i pazienti. I dati clinicopatologici sono stati estratti dalle cartelle cliniche dei pazienti e il tempo medio di follow-up è stato di 4,19 anni. I pazienti HPV positivi erano caratterizzati da stadi T inferiori con il 45% (26 su 58; p = 0,025) dei pazienti HPV positivi che mostravano tumori allo stadio T1/2, mentre questo era il 29% (51 su 175; p = 0,025) nel gruppo HPV negativo. Inoltre, i tumori positivi all’HPV hanno mostrato significativamente più alti (p = 0.014) coinvolgimento nodale con il 72% (42 su 58) dei pazienti HPV positivi che mostrano tumori N2/N3 mentre questo era solo il 54% (95 su 175) nel gruppo HPV negativo. Sebbene la relazione tra lo stato p16 e lo stadio N non fosse significativa, è stata osservata una tendenza a un maggiore coinvolgimento nodale e alla positività di p16. Il sessantatré% dei pazienti p16 positivi ha mostrato tumori N2 / N3, mentre questo era solo il 54% nel gruppo p16 negativo (Tabella 1). Questi risultati sono in concordanza con altri studi, mostrando che i pazienti HNSCC positivi all’HPV hanno stadi N e T più alti.
Come anticipato, bassa T tappe comportato meglio un controllo a distanza (CC) costo di 5 anni con tassi di controllo dell ‘ 83% e il 70% (p = 0,04) per T1/T2 e T3/4 tumori, rispettivamente (file Aggiuntive 1: Figura S1A). I tumori N2/3 (DC a 5 anni 70%; p = 0,02) hanno mostrato un rischio più elevato di fallimento a distanza rispetto ai tumori N0/1 (tasso DC a 5 anni 85%; p = 0,02) (File aggiuntivo 1: Figura S1B). Non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa nel tasso di DC tra malattia positiva e negativa per HPV (tasso di DC a 5 anni dell ‘ 82% vs tasso di DC a 5 anni del 72% rispettivamente; p = 0,20) (File aggiuntivo 1: Figura S1C). Sebbene non significativo, questa differenza del 10% nei tassi di CC suggerisce l’influenza del virus oltre il controllo locale del tumore. Inoltre, indica la presenza di diversi modelli di disseminazione tra HPV positivo e negativo HNSCC.
p16 reprime la capacità di invasione e migrazione di HPV positivi HNSCC
Per studiare il meccanismo molecolare alla base di queste potenziali differenze osservate nelle metastasi nella nostra coorte di pazienti, abbiamo valutato la capacità di migrazione e invasione in vitro delle cellule HNSCC. Le cellule SCC154 e SCC104 positive all’HPV/p16 hanno mostrato un significativo tasso di migrazione inferiore rispetto alle cellule SQD9, CAL27 e SC263 negative all’HPV/p16 (Fig. 1 bis). In accordo con il test di migrazione, le cellule HPV / p16 positive hanno mostrato una ridotta capacità di invasione rispetto alle cellule HPV / p16 negative (Fig. 1 ter).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). d Capacità di invasione di cellule SCC154 HPV positive trattate con shRNA per p16 (shp16) e controllo (shluc). (a-d) Il risultato è mostrato come media ± SEM di tre esperimenti e p-valori sono calcolati da due lati t-test
Il soppressore tumorale p16 è un regolatore del ciclo cellulare ben noto e un buon marcatore surrogato per HPV HNSCC positivo . Inoltre, dati recenti attribuiscono un ruolo più ampio per p16, incluso un ruolo nella migrazione e nella repressione dell’angiogenesi . Pertanto, abbiamo anche esaminato l’influenza di p16 sulla capacità di migrazione e invasione delle cellule SCC154 positive all’HPV manipolate con RNA a forcina corta (shRNA) per p16 (shp16) e controllo shRNA (shluc). Downregulation dell’espressione p16 aumento delle capacità di migrazione e invasione delle celle SCC154 (Fig. 1c e d). Questi dati verificano la presenza di differenze nei modelli di disseminazione tra HPV positivo e HNSCC negativo e suggeriscono un ruolo attivo di p16 nella cascata metastatica.
p16 sopprime la migrazione e l’invasione attraverso l’angiogenesi in HPV positivo HNSCC
È ben noto che l’angiogenesi, che è attivamente sostenuta nelle cellule tumorali da fattori pro-angiogenici come il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA), è un condotto per la diffusione e la metastasi delle cellule tumorali e promuove la progressione aggressiva del tumore . Inoltre, la correlazione negativa tra HPV/p16 e VEGFA è stata precedentemente descritta in HNSCC . Pertanto, abbiamo valutato la relazione tra HPV, p16 e VEGFA nella nostra coorte di pazienti. I pazienti positivi all’HPV hanno mostrato un’espressione di VEGFA significativamente più bassa con il 54% (28 su 51) dei pazienti che hanno mostrato un’espressione di VEGFA assente o bassa rispetto al 32% (53 su 161) nel gruppo HPV negativo (Tabella 2). Sebbene la correlazione negativa tra VEGFA e p16 fosse meno pronunciata, è stata osservata una tendenza alla significatività (Tabella 2).
ulteriormente, Abbiamo studiato la relazione tra l’angiogenesi e p16 con in vivo xenotrapianti iniettato con SCC154 HPV positivo cellule manipolate con shp16 o shluc. Un numero maggiore di vasi sanguigni è stato rilevato nei tumori dei topi con bassa espressione di p16 rispetto ai tumori di controllo (Fig. 2 bis). Inoltre, l’aumento della vascolarizzazione ha comportato una necrosi inferiore, un numero maggiore di cellule mitotiche e un vantaggio di crescita dei tumori che esprimono shp16 (File aggiuntivo 2: Figura S2A-C). Non abbiamo potuto verificare il coinvolgimento di p16 nella soppressione delle metastasi in vivo a causa dell’assenza di un modello animale metastatico. Tuttavia, il vantaggio di crescita e l’aumento della vascolarizzazione osservato nei tumori dei topi shp16 possono spiegare il frequente verificarsi di stadi T avanzati nei pazienti HNSCC negativi all’HPV.
Doppio ruolo di p16 nella diffusione di HNSCC. formazione di vasi sanguigni nei modelli murini di xenotrapianto SCC154 shp16 e SCC154 shluc valutati mediante colorazione CD31( sopra il grafico); n = 5. b Numero medio di formazione di vasi linfatici nei modelli murini di xenotrapianto SCC154 shp16 e SCC154 shluc valutati mediante colorazione LYVE-1 (sopra il grafico); n = 5. c Punteggio medio della colorazione dell’integrina alpha4 beta1 nei modelli di xenotrapianto di topi SCC154 shp16 e SCC154 shluc; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-d P-i valori sono calcolati su due lati t-test
p16 stimola linfangiogenesi e l’interessamento linfonodale in positivo HPV HNSCC
Questi risultati continuano a non spiegare il verificarsi di simili distanti tassi di recidiva nel HPV/p16 positivi e negativi HNSCC pazienti e di certo non spiegare altamente significativa associazione tra HPV positività e di coinvolgimento linfonodale descritto nel nostro e di molti altri studi . Ciò è particolarmente importante poiché implica la presenza di un alto potenziale metastatico locale in HNSCC positivo per HPV. È interessante notare che la linfangiogenesi, come l’angiogenesi, promuove la metastasi tumorale inducendo la crescita di nuovi vasi linfatici all’interno del tumore e migliorando il traffico cellulare ai linfonodi. Inoltre, l’aumento della densità dei vasi linfatici nei tumori è associato ad un aumento delle metastasi ai linfonodi. . Pertanto, abbiamo valutato la formazione del vaso linfatico mediante immunocontenente del vaso linfatico dell’omologo hyaluronan (LYVE-1) nei tumori dei topi shluc e shp16. Abbiamo scoperto che la soppressione di p16 ha portato a una minore densità dei vasi linfatici negli xenotrapianti HPV / p16 positivi suggerendo un duplice ruolo di p16 nelle metastasi (Fig. 2 ter).
Per comprendere la funzione di p16, ci siamo concentrati sulle integrine in quanto queste proteine sono accettate come regolatori chiave dell’angiogenesi e della linfangiogenesi . Inoltre, il legame di p16 con le integrine e la perdita di diffusione cellulare è precedentemente documentato . Le integrine come alpha4 beta1 sono importanti modulatori della linfangiogenesi . Pertanto, abbiamo valutato la presenza di integrina alpha4 beta1 nei tumori dei topi SCC154 shluc e SCC154 shp16. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).