Le reazioni biochimiche, anche quelle complesse come la replica del genoma del DNA delle cellule, seguono il principio che il processo è regolato sia dalla concentrazione del substrato che dagli enzimi che mediano il processo. I trifosfati deossinucleosidici (dNTPs), i substrati per gli enzimi polimerizzanti del DNA, sono noti da tempo per essere limitati nella loro concentrazione nelle cellule perché l’enzima che sintetizza i deossinucleotidi dai ribonucleotidi, la ribonucleotide reduttasi (RNR), viene sintetizzato e attivato enzimaticamente quando le cellule entrano nella fase S (1, 2). RNR, scoperto da Peter Reichard 52 anni fa (3), converte tutti e quattro i difosfati ribonucleotidici (rNDPs) nei rispettivi disposfati deossinucleosidici (dNDPs), che vengono poi rapidamente convertiti in dNTP. Bassi livelli e attività di RNR forniscono DNTP sufficienti per la sintesi del DNA mitocondriale e per la riparazione del DNA nelle cellule non cicliche e durante la fase G1 del ciclo di divisione cellulare nelle cellule proliferanti, ma i livelli e l’attività di RNR sono enormemente aumentati man mano che le cellule si impegnano a replicare il DNA durante la fase S del ciclo di divisione cellulare o dopo un’ampia riparazione del DNA (4). Infatti, RNR è uno degli enzimi più altamente regolati conosciuti. L’enzima mammifero sintetizza tutti e quattro i dNDPs in un ciclo, viene attivato allostericamente da dATP, dTTP e dGTP per bilanciare i livelli relativi dei quattro DNTP (dCTP, dTTP, dGTP e dATP) ed è inibito dal feed-back da dATP, perché dATP è l’ultimo dNTP da effettuare nel ciclo di sintesi di tutti e quattro i DNTP da un singolo enzima RNR (1). Specifiche proteine inibitorie (nei lieviti) controllano anche l’attività RNR e i livelli di subunità RNR sono regolati dalla trascrizione dipendente dal ciclo cellulare dei geni che codificano le subunità e dalla stabilità delle proteine delle subunità (4, 5). Sulla base di queste osservazioni, ci si potrebbe aspettare che la sintesi dNTP da RNR dovrebbe essere sufficiente per controllare come e quando la replicazione del DNA del genoma si verifica perché RNR è solo al massimo attivo durante la fase S. Tuttavia, studi recenti, compresi quelli che emergono da studi lontani su come la replicazione dell’HIV è limitata a determinati tipi di cellule (6, 7), hanno scoperto un nuovo controllo dei livelli di dNTP, la distruzione di dNTP. Il motivo alfa sterile e il dominio HD contenente la proteina 1 (SAMHD1) è una trifosfoidrolasi deossinucleoside che scinde i DNTP nel rispettivo deossinucleoside e un trifosfato (8). In PNAS, Franzolin et al. (9) mostrano che la distruzione del dNTP da parte del SAMHD1 contribuisce anche al controllo della concentrazione di dNTP durante il ciclo di divisione cellulare delle cellule proliferanti, influenzando così sia la replicazione del DNA che la progressione del ciclo cellulare.

SAMHD1 contiene due domini riconosciuti, un dominio SAM (sterile alpha motif) a funzione sconosciuta e un dominio HD che contiene acido aspartico catalitico e residui di istidina che formano il nucleo catalitico dell’enzima (8). SAMHD può idrolizzare dGTP solo quando ogni dNTP è fornito singolarmente, ma può idrolizzare dTTP, dCTP e dATP quando dGTP è presente come cofattore. dGTP molto probabilmente agisce come un attivatore allosterico dell’enzima dimerico (8), anche se un recente rapporto suggerisce che l’enzima può funzionare come un tetramero (10). L’osservazione che SAMHD1 può degradare dGTP da solo e che lo stesso dNTP può attivare allostericamente la trifosfoidrolasi può essere un meccanismo per bilanciare le concentrazioni di tutti e quattro i DNTP nella cellula. È possibile che i livelli di dNTP siano determinati dall’affinità di dGTP al sito allosterico di SAMHD1.

Franzolin et al. (9) dimostrare che il SAMHD1 è intimamente coinvolto nel controllo dei livelli di dNTP, non solo nelle cellule non ciclabili in cui l’enzima è abbondantemente espresso, ma anche nelle cellule ciclanti. La loro osservazione termina la precedente nozione che la sintesi di dNTPs da parte di RNR era il principale meccanismo che regolava la concentrazione intracellulare di dNTPs durante il ciclo cellulare. SAMHD1 è presente nel nucleo delle cellule di fase G1, mentre le subunità RNR sono prominenti nel citoplasma, aumentando i loro livelli nelle cellule di fase S (9). L’esaurimento dei livelli di SAMHD1 nelle cellule cicliche ha aumentato la concentrazione di dNTP nelle cellule non in fase S e ha causato un arresto nella fase G1. È interessante notare che la deregolamentazione dell’inibizione del feedback di RNR nelle cellule di lievito ha causato livelli elevati di dNTP e un arresto nella fase G1, quindi i livelli di dNTPs hanno un effetto diretto sul controllo della progressione del ciclo cellulare (11). Concentrazioni incontrollate e alte di dNTP sono note per essere mutagene per la replicazione del genoma (12), che è molto probabilmente il motivo per cui le cellule fanno di tutto per accoppiare intimamente la concentrazione di tutti e quattro i DNTP alla sintesi del DNA durante la fase S.

Il gene che codifica SAMHD1 è stato scoperto come un gene indotto da IFN-γ nei macrofagi peritoneali del topo (13). L’induzione di SAMHD1 in cellule differenziate ora ha senso perché solo bassi livelli di dNTP sarebbero necessari nelle cellule non proliferanti per mantenere i mitocondri e per la riparazione del DNA. È probabile che alti livelli di dNTP possano causare problemi con il mantenimento della funzione mitocondriale, che potrebbero verificarsi in pazienti con sindrome di Aicardi-Goutières (AGS), un’encefalopatia infiammatoria geneticamente ereditata che assomiglia clinicamente alle infezioni virali congenite e ad alcuni tipi di autoimmunità (14). Le mutazioni AGS nel gene SAMHD1 riducono l’attività catalitica o l’attivazione allosterica da parte del dGTP, causando entrambi un aumento dei livelli intracellulari di dNTP, che possono contribuire alla differenziazione difettosa delle cellule immunitarie innate.

Di interesse è l’osservazione che SAMHD1 limita alcuni lentivirus, tra cui HIV1, dalla replica in cellule non riciclabili perché i livelli di dNTP non sono sufficienti per la trascrittasi inversa per copiare il modello di RNA in arrivo. Alcuni lentivirus, come HIV2 e il virus dell’immunodeficienza simiana, trasportano una proteina chiamata Vpx che causa la degradazione di SAMHD1, consentendo così un aumento dei DNTP e la copia del genoma dell’RNA nel DNA (6, 8, 15). Il Km per le diverse trascrittasi inverse varia e contribuisce alla specificità della cellula ospite per la replicazione del virus, un processo influenzato dalla presenza o dall’assenza di SAMHD1 (16). Il fenotipo di AGS è coerente con le mutazioni di SAMHD1 che causano livelli più elevati di dNTP che, a loro volta, potrebbero portare a un’infezione virale più robusta per i virus che hanno una DNA polimerasi con un Km che richiede un aumento dei livelli di dNTP. Tuttavia, solo i virus che codificano i propri enzimi polimerizzanti del DNA si replicheranno in cellule non riciclabili, perché il macchinario cellulare che replica il DNA ospite non è attivo. Una volta rimossa la potente attività dNTP triphophohydrolase di SAMHD1, la polimerasi del virus può replicare il genoma del virus. Pertanto, i virus a DNA, come il virus herpes simplex di tipo 1 e il virus vaccinia, che codificano le proprie DNA polimerasi, possono replicarsi in cellule non riciclabili se SAMHD1 viene rimosso (17).

La sorprendente osservazione di Franzolin et al. (9), che nelle cellule ciclanti SAMHD1 non è presente nella fase S, suggerisce che è degradato da proteolisi ubiquitina-dipendente come le cellule transitano dalla fase G1 nella fase S. La proteina SAMHD1 può essere fosforilata dalla ciclina A-CDK2 (18). Questa chinasi è attivata alla transizione di fase G1-S nelle cellule umane ed è responsabile dell’inizio della sintesi effettiva del DNA da complessi prereplicativi che sono stati assemblati durante la fase G1 a tutte le origini della replicazione del DNA (19). Una possibilità è che la fosforilazione di SAMHD1 inneschi la proteolisi mediata da Ub dell’enzima nella transizione di fase da G1 a S (Fig. 1).

Studi recenti hanno dimostrato che SAMHD1 è fosforilato in un sito CDK, T592 (18, 20). Le mutazioni che alterano o imitano la fosforilazione a questo residuo hanno perso la loro capacità di limitare la replicazione dell’HIV. Questi mutanti hanno mantenuto la loro capacità di idrolizzare il TTP in presenza di dGTP e non hanno alterato i livelli di dNTP nelle cellule (20). Sulla base di queste osservazioni, è stata sollevata la possibilità che la capacità di SAMHD1 di limitare la replicazione del retrovirus non fosse dovuta alla sua capacità di degradare i DNTP cellulari. Tuttavia, questa conclusione deve ora essere temperata alla luce dei recenti risultati di Franzolin et al. (9), perché i livelli di dNTP nelle cellule che esprimono wild-type rispetto a SAMHD1 mutante sono stati misurati in cellule non ciclabili (cellule mieloidi U937 stimolate da PMA). Al contrario, la capacità delle proteine wild-type e mutanti di limitare la replicazione retrovirale è stata misurata nelle cellule cicliche. Forse nelle cellule non ciclanti l’attività della fosfoidrolasi dNTP non è influenzata dalla fosforilazione perché la chinasi è assente, o la pertinente E3-ligasi che ha mediato la degradazione Ub-dipendente di SAMHD1 non è espressa. Nelle cellule ciclanti, tuttavia, sia la ciclina A-CDK2 che la E3-ligasi potrebbero indurre la distruzione di SAMHD1, aumentando i livelli di dNTP e consentendo la replicazione del virus. Chiaramente, sono necessari studi futuri per esplorare il modo in cui i livelli di SAMHD1 sono controllati sia nelle cellule in bicicletta che in quelle non in bicicletta. È importante sottolineare che l’osservazione che solo le cellule cicliche in fase G1 esprimono SAMHD1 dovrà essere presa in considerazione nell’interpretare i risultati su come l’attività di SAMHD1 influisce sia sulla replicazione del genoma che del DNA del virus e su come i DNTP possono influenzare la funzione cellulare nell’immunità innata. Nonostante 52 y di indagare sul metabolismo dNTP, sembra che ci sia molto di più da fare!