La fortuita scoperta di adenosina deaminasi (ADA) deficit in due pazienti con cellulare deficit immunitario nel 1972 dal Dr. Eloise Giblett e colleghi (1) per inaugurare una nuova era nell’indagine dei meccanismi molecolari alla base primaria dell’immunodeficienza disturbi. Inoltre, questa scoperta ha portato allo sviluppo finale di nuove terapie non solo per la carenza di ADA, ma anche per altri disturbi da immunodeficienza e alcune leucemie. Nei primi anni 1970, diverse malattie da immunodeficienza primaria, tra cui SCID, X-linked a gamma globulinemia, e la sindrome di Wiskott-Aldrich, erano ben noti agli immunologi pediatrici e presumibilmente causati da difetti genetici singoli basati su modelli di ereditarietà. Tuttavia, i difetti genetici responsabili di questi disturbi devastanti erano sconosciuti. A quei tempi, l’unica” cura ” per gravi malattie da immunodeficienza era un trapianto di midollo osseo (BMT) da un donatore istocompatibile. Nel caso di uno dei due pazienti descritti da Giblett et al., la tipizzazione di routine di HLA di membri di famiglia non è riuscita a identificare donatori adatti. Così, i medici del paziente hanno inviato campioni di sangue al dottor Giblett presso la King Country Central Blood Bank. Si sperava che potesse far luce sulle relazioni tra i membri della famiglia del paziente esaminando i modelli di isozima per l’enzima ADA. Con sua grande sorpresa, l’elettroforesi su gel di amido indicava che i globuli rossi del paziente erano completamente privi di attività enzimatica ADA! I genitori hanno mostrato attività ADA rilevabile, ma ridotta, suggerendo una modalità di ereditarietà autosomica recessiva. Successivamente, un secondo paziente con immunodeficienza cellulare severa è stato studiato ed inoltre è risultato essere ADA-carente. Questi erano risultati completamente inaspettati, poiché non vi era alcuna precedenza per la carenza di ADA negli esseri umani o per l’ADA che svolgeva un ruolo importante nello sviluppo o nella funzione del sistema immunitario.

ADA fa parte della via di recupero delle purine che include l’enzima ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi (HPRT). Mutazioni nel gene HPRT erano note per causare il disturbo neurologico Sindrome di Lesch-Nyhan e la sua associata artrite gottosa (2), ma questo percorso non è stato pensato per essere importante per il sistema immunitario. Giblett e colleghi hanno proposto che i due pazienti potrebbero avere rari alleli mutanti per il gene ADA. In alternativa, è stato ipotizzato che potrebbero avere una breve delezione cromosomica che comprende il gene ADA e un vicino gene di risposta immunitaria critica. In entrambi i casi, hanno concluso: “Poiché ADA anenzymia e le malattie ereditarie dell’immunità cellulare sono estremamente rare, la loro coesistenza in due pazienti non correlati sembra molto improbabile che sia fortuita.”

Le misurazioni dei metaboliti purinici nei fluidi corporei di pazienti con deficit di ADA hanno mostrato livelli elevati di adenosina (3), uno dei due substrati per ADA. I ricercatori hanno rapidamente dimostrato che l’adenosina potrebbe rallentare la crescita delle linee cellulari linfoidi e la proliferazione indotta da mitogeno dei linfociti primari (3). Nel 1975, Giblet e colleghi hanno riportato un paziente con immunodeficienza isolata delle cellule T che mancava di attività della fosforilasi nucleosidica purinica (PNP) (4), un enzima situato tra ADA e HPRT nella via di recupero delle purine, fornendo prove convincenti dell’importanza critica del normale metabolismo delle purine per un sistema immunitario funzionante. Sebbene sia stato originariamente riportato che l’ATP era elevato nei globuli rossi dei pazienti con deficit di ADA (5), schemi di separazione HPLC più sensibili nei laboratori della dottoressa Mary Sue Coleman e Amos Cohen hanno rivelato che anche i livelli di dATP erano elevati (6,7). Questa scoperta ha confermato una precedente speculazione del Dr. Dennis Carson et al. (8) che la deossiadenosina, l’altro substrato di ADA, piuttosto che l’adenosina, era il metabolita tossico in questa malattia. Successivi esperimenti hanno dimostrato che la deossiadenosina viene convertita prima in umido e infine in dATP dagli alti livelli di chinasi desossinucleosidiche nel timo. Un probabile meccanismo patogeno è il rilascio del citocromo c innescato da dATP dai mitocondri che innesca una cascata apoptotica, portando al fallimento dello sviluppo delle cellule T (9). È interessante notare che la comprensione di questo percorso ha portato allo sviluppo di nuovi approcci chemioterapici di successo per il trattamento della leucemia a cellule capellute (10).

Sia ADA che PNP sono espressi praticamente in ogni cellula del corpo ed erano stati considerati come geni “domestici”. Quindi, una domanda immediata era perché gli effetti della carenza di ADA erano focalizzati sul sistema immunitario. Ciò ha portato a una valutazione sistematica dell’espressione degli enzimi che metabolizzano le purine in vari tessuti umani e alla scoperta che ADA è stata trovata a livelli molto alti nel timo, suggerendo che questo organo aveva sviluppato un meccanismo per prevenire l’accumulo di substrati di ADA. Questo è necessario perché l’alto tasso di morte cellulare nel timo secondario agli eventi di selezione fornisce una fonte di DNA che viene degradata a deossiadenosina. Questo, insieme ad alti livelli di desossinucleoside chinasi, spiega perché il timo dei pazienti carenti di ADA accumula livelli così elevati di dATP (8).

In aggiunta alla normale terapia di supporto somministrata a pazienti con SCID, i pazienti con deficit di ADA sono stati inizialmente trattati con trasfusioni di RBC confezionate come una sorta di terapia “enzimatica sostitutiva” (5). Molti pazienti hanno mostrato un miglioramento significativo della funzione immunitaria di conseguenza, specialmente quelli con attività enzimatica residua ADA. La svolta nel trattamento di questi pazienti è arrivata con lo sviluppo di polietilene glicole (PEG)-modificato bovino ADA dalla società biotech Enzon. PEG-ADA (Adagen) è stato il primo farmaco proteico PEG-modificato approvato dalla FDA. Il suo uso come terapia per pazienti con deficit di ADA è stato sostenuto dal Dr. Michael Hershfield a Duke (11). Molti pazienti che non hanno donatori di midollo osseo adatti sono stati in grado di condurre una vita ragionevolmente normale come risultato del trattamento con PEG-ADA. Oggi, ci sono un certo numero di farmaci a base di proteine sul mercato che vengono modificati mediante pegilazione per migliorare la stabilità e diminuire l’immunogenicità. Questi includono Neulasta (Amgen) per il trattamento della leucemia, interferone-β per il trattamento dell’epatite cronica C e uricase per il trattamento della gotta refrattaria (12).

La carenza di ADA ha anche svolto un ruolo di primo piano nello sviluppo della terapia genica. Era la malattia perfetta per questo campo nascente. Era già noto che i pazienti con SCID potevano essere curati da un BMT da un donatore istocompatibile. Era anche noto che i pazienti con solo il 10-12% della normale attività enzimatica ADA avevano un sistema immunitario normale (13). Pertanto, era logico prevedere che la BMT autologa con cellule di midollo osseo geneticamente modificate avrebbe avuto un valore terapeutico, anche se non è stato possibile raggiungere livelli normali di espressione genica. Tuttavia, i tentativi iniziali non hanno avuto successo perché il piccolo numero di cellule geneticamente modificate non è stato mantenuto dopo il trapianto (14). Tuttavia, questo approccio ha avuto successo nei pazienti con SCID X-linked perché le cellule geneticamente modificate avevano un vantaggio selettivo e alla fine superavano le restanti cellule non modificate (15). Questa realizzazione ha portato all’ipotesi che la terapia genica per la carenza di ADA non abbia avuto successo perché i pazienti sono stati mantenuti su PEG-ADA come una sorta di standard di cura. Questo trattamento ha rimosso il vantaggio selettivo che le cellule corrette dal gene ADA avrebbero goduto in un ospite altrimenti carente di ADA. Infatti, quando i protocolli di trattamento sono stati modificati per rimuovere il PEG-ADA, la terapia genica per questo disturbo ha avuto successo, anche se di solito ci sono voluti un anno o più per il numero di cellule T corrette dal gene per raggiungere i livelli massimi (16).

Come per molte malattie umane, gli immunologi hanno sviluppato modelli murini per avere un sistema sperimentale in cui le conseguenze della carenza di ADA potrebbero essere studiate e nuove strategie di trattamento valutate. Con grande sorpresa degli investigatori che hanno creato topi carenti di ADA, questi topi sono morti nell’immediato periodo perinatale-non di immunodeficienza, ma di insufficienza epatica (17,18). Al momento della morte, l’effetto della carenza di ADA sullo sviluppo del timo era relativamente modesto. Per aggirare questo problema, è stato sviluppato un ceppo di topi che era globalmente carente di ADA tranne che controllato con un promotore specifico della placenta (19). Così, hanno avuto ADA durante lo sviluppo fetale e sono diventati carenti di ADA solo dopo la nascita. Sorprendentemente, avevano una normale funzionalità epatica, dimostrando che l’ADA era necessaria nel fegato durante lo sviluppo fetale, ma non successivamente. Altrettanto sorprendente, questi topi sono morti a circa 3 settimane di età di insufficienza respiratoria (20). Tuttavia, potrebbero essere mantenuti su PEG-ADA indefinitamente. Quando era subottimale, hanno sviluppato l’immunodeficienza come originariamente previsto (21). Questi topi si sono dimostrati utili per esaminare i meccanismi dello SCID carente di ADA (9). Inoltre, a causa dell’accumulo di adenosina, questi animali hanno servito come schermo biologico per i disturbi associati alla segnalazione aberrante del recettore dell’adenosina (22). Negli ultimi venti anni, è diventato sempre più evidente che l’adenosina regola molti aspetti importanti della fisiologia attraverso il legame a quattro distinti recettori dell’adenosina accoppiati a sette proteine transmembrana (23). Sebbene l’adenosina sia solitamente immunosoppressiva e antinfiammatoria, il lavoro nei topi carenti di ADA ha aiutato a scoprire nuovi ruoli per l’adenosina nel promuovere la progressione di malattie croniche tra cui asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva e fibrosi polmonare (22). Inoltre, questi topi hanno contribuito a definire un nuovo ruolo per la segnalazione di adenosina in alcune manifestazioni di anemia falciforme (24).

In conclusione, la scoperta della carenza di ADA come causa di SCID è stata rivoluzionaria per diversi motivi. In primo luogo, è stata la prima malattia da immunodeficienza per la quale è stato identificato il difetto molecolare, consentendo di effettuare una diagnosi molecolare sia pre che postnatale. In secondo luogo, ha sottolineato l’importanza del normale metabolismo delle purine per lo sviluppo del sistema immunitario. La comprensione dei meccanismi della SCID carente di ADA ha portato allo sviluppo di inibitori dell’ADA e analoghi della deossiadenosina per il trattamento della leucemia a cellule capellute (10). PEG-ADA è diventato la prima proteina PEG-modificata da utilizzare come terapeutico e ha aperto la porta allo sviluppo di ulteriori proteine PEG-modificate che sono oggi in largo uso clinico. La carenza di ADA è stata la prima malattia ereditaria ad essere trattata con terapia genica. Infine, i topi carenti di ADA sono diventati uno strumento inestimabile per lo studio della segnalazione del recettore dell’adenosina nelle malattie polmonari croniche e nell’anemia falciforme. Pertanto, la storia delle indagini sulla carenza di ADA avviate dalla sorprendente assenza di bande ADA sul gel di amido di Eloise Giblett, illustra il potenziale impatto delle scoperte fortuite nella scienza e nella medicina e le ricompense impreviste che possono derivare dallo studio di pazienti con malattie rare.