I batteriofagi, chiamati anche fagi, sono virus che infettano specificamente i batteri e possiamo confermare la loro presenza e quantificarli utilizzando uno strumento chiamato test della placca. I batteriofagi infettano i loro ospiti sensibili attaccandosi prima alla parete cellulare batterica e iniettando il loro materiale genetico. Quindi, dirottano il macchinario biosintetico della cellula per replicare il loro DNA e produrre numerose particelle di fago progenie, che poi rilasciano lisando e uccidendo la cellula ospite.

Questa attività litica è alla base di una tecnica di enumerazione dei fagi ampiamente utilizzata nota come test di placca o test a doppio strato di agar. Qui, una miscela di batteriofagi viene prima preparata in un brodo nutriente fuso contenente agar a bassa concentrazione. Tutti i batteri utilizzati nel mix dovrebbero essere vivi e dividersi attivamente nella fase di log della loro crescita, il che garantirà che una grande percentuale dei batteri sia vitale e in grado di formare un prato denso attorno alle placche. Successivamente, questa miscela fusa di agar batterico-fago si sviluppa su un mezzo nutritivo agar più solido e concentrato che è già solidificato su una capsula di Petri. Durante l’incubazione a temperatura ambiente, il brodo di batteri agar-fagi a bassa concentrazione si solidifica anche per formare una sovrapposizione di agar morbido.

Qui, le cellule batteriche possono ricavare ulteriori nutrienti dallo strato inferiore e dovrebbero moltiplicarsi rapidamente per produrre un prato confluente di batteri. Tuttavia, poiché le particelle di fago sono presenti anche nello strato morbido, queste infetteranno e replicheranno il loro materiale genetico all’interno dei batteri, culminando nella lisi cellulare, che rilascia più progenie. Queste progenie di fagi infettano quindi le cellule vicine, poiché lo stato semi-solido dello strato di batteri-fagi limita il loro movimento alle cellule ospiti più distanti. Questo ciclo di infezione e lisi continua su più turni, uccidendo un gran numero di batteri in un’area localizzata. L’effetto della distruzione delle cellule vicine è quello di produrre una singola zona circolare chiara, chiamata placca, che può essere vista ad occhio nudo, amplificando efficacemente l’attività litica dei batteri del fago e consentendo la loro enumerazione.

Il numero di placche su una capsula di Petri è indicato come Unità formanti placche o PFU e, a condizione che la concentrazione iniziale del batteriofago sia sufficientemente diluita, dovrebbe corrispondere direttamente al numero di particelle di fagi infettivi nel campione originale. Questa tecnica può anche essere utilizzata per caratterizzare la morfologia della placca, per aiutare nell’identificazione dei tipi di fagi o per isolare i mutanti dei fagi. In questo laboratorio, imparerai come eseguire il test della placca per enumerare i fagi, usando il fago T7 di E. coli come esempio.

In primo luogo, identificare un mezzo adatto per la coltura delle cellule batteriche ospiti e del batteriofago. Qui il brodo di lisogenesi, o mezzo LB, è stato utilizzato per la coltura di E. coli e del fago T7. Quindi, prendi tre bottiglie di vetro pulite e etichettale con i media, il nome e poi il primo come LB-Broth, il secondo come LB-Bottom Agar e il terzo come LB-Top Agar. Ora, pesare quattro grammi di polvere LB pre-formulata in tre set e quindi trasferire un set di supporti essiccati pesati in ogni bottiglia. Aggiungere 200 millilitri di acqua alla prima bottiglia. Mescolare il contenuto usando una barra di agitazione magnetica.

Quindi, utilizzando un pH-metro e costante agitazione, portare il pH finale a 7,4 attraverso l’aggiunta di idrossido di sodio o acido cloridrico. Ripetere l’aggiunta di acqua e la regolazione del pH per le altre due bottiglie rimanenti, pure. Ora, pesare tre grammi di polvere di agar e aggiungerlo alla seconda bottiglia per ottenere un agar inferiore dell ‘ 1,5%. Infine, pesare 1. 2 grammi di agar e aggiungerlo alla terza bottiglia per rendere il .6% LB agar superiore. La condizione di brodo in bottiglia uno non ha bisogno di un’aggiunta di agar. Tappare la bottiglia semi-strettamente e poi, sterilizzare il supporto in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Una volta completato, rimuovere i flaconi dall’autoclave e ruotare immediatamente i tappi per chiuderli completamente per evitare la contaminazione. Tenere il LB-Brodo e LB – Top Agar media sul banco per un uso successivo. Posizionare l’Agar LB-Bottom per raffreddare in un bagno d’acqua che è preimpostato a circa 45 gradi Celsius.

Quando l’agar LB-Bottom raggiunge circa 45 gradi Celsius, trasferirlo sul banco di lavoro. Successivamente, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando il 70% di etenolo. Successivamente, aggiungere 450 microlitri di cloruro di calcio molare sterile all’agar di fondo fuso per ottenere una concentrazione finale di 2.25 millimolare. Ruotare delicatamente la bottiglia per mescolare. Quindi, impostare sette piatti di Petri puliti. Etichettare ogni piatto sul fondo con il nome del supporto e la data di preparazione. Quindi, versare 15 millilitri di agar inferiore in ciascuna delle sette piastre di Petri. Lasciare le piastre per impostare per alcune ore o durante la notte a temperatura ambiente. Una volta impostate, le piastre di coltura possono essere conservate a quattro gradi Celsius per diversi giorni se necessario, capovolte per ridurre al minimo la condensa. Trasferire le piastre di Petri dal frigorifero a quattro gradi Celsius a un incubatore a 37 gradi Celsius un’ora prima del test.

Il giorno prima che il test sia preformato, l’E. coli deve essere coltivato. Qui, 10 microlitri di coltura di E. coli sono stati inoculati in 10 millilitri di brodo LB. Posizionare i batteri a crescere durante la notte in un incubatore agitazione impostato a 37 gradi Celsius a 160 RPM. Quindi, il giorno del test, rimuovere la coltura batterica dall’incubatore. Seminare un fresco 10 millilitri di brodo LB fresco con 0,5 millilitri della coltura durante la notte. Posizionare queste cellule a crescere in un incubatore agitazione impostato a 37 gradi Celsius a 160 RPM. Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro per verificare quando questa coltura raggiunge la crescita della fase di log, indicata da una densità ottica da 0,5 a 0,7. Una volta che l’OD raggiunge questo livello, interrompere l’incubazione trasferendo la coltura cellulare al banco. Ora sono pronti per essere utilizzati per il test di sovrapposizione dei fagi.

I titoli dei fagi possono variare esponenzialmente tra diversi tipi di fagi e campioni. Quindi, per contarli in modo efficace, dovrebbero essere diluiti per generare una vasta gamma di concentrazioni di fagi. Il giorno del test, generare una serie di diluizioni di fagi che vanno da un decimo a un milionesimo di concentrazioni, seguendo una tecnica di diluizione di 10 volte. Per ottenere dati statisticamente significativi e precisi, eseguire la diluizione seriale in triplice copia.

Successivamente, sciogliere l’agar LB-top solidificato utilizzando un forno a microonde. Quindi, posizionarlo in un bagno d’acqua preimpostato a 45 gradi Celsius per un’ora. Dopo un’ora, raccogliere le piastre di Petri contenenti lo strato di agar inferiore dall’incubatore. Etichettare le piastre con concentrazione di fagi e data di dosaggio. Quindi, impostare sette provette pulite. Etichettare ogni provetta con il numero di diluizione del fago seriale e designarne uno come controllo.

Quando l’agar LB-top raggiunge i 45 gradi Celsius, trasferirlo sul banco di lavoro. Ora, aggiungere 450 microlitri di un cloruro di calcio molare all’agar da 200 millilitri per ottenere una concentrazione finale di 2,25 millimolare. Ruotare delicatamente la bottiglia per mescolare. Successivamente, aggiungere 35 millilitri di agar LB-top e quattro millilitri di sospensione batterica a un tubo conico sterile. Ruotare delicatamente per distribuire uniformemente le cellule, ma evitare di scuotere per evitare la formazione di schiuma.

Ora, aliquota cinque millilitri di questo batteri-top agar mescolare a ciascuna delle sette provette. Quindi, trasferire 100 microlitri dei campioni di batteriofago diluiti in serie e dei mezzi di controllo, che dovrebbero essere semplicemente supporti senza batteriofago, nelle provette etichettate con rispetto. Agitare delicatamente la miscela per garantire una corretta miscelazione. Trasferire delicatamente cinque millilitri di miscela di batteriofagi sulla rispettiva piastra di Petri. Distribuire uniformemente la miscela su tutta la superficie ruotando delicatamente la piastra di Petri.

Una volta che tutte le piastre di Petri sono stratificate con la miscela, consentire la solidificazione dello strato superiore incubando a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo il completamento di questi passaggi, ripetere il processo per il secondo e poi il terzo set delle piastre di Petri utilizzando i restanti due set di diluizioni di fagi. Sigillare ogni piatto con parafilm e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Posizionare la piastra di coltura capovolta a una temperatura adatta per 24 ore o fino a quando si sviluppano placche. Qui, le piastre sono state poste in un incubatore di 37 gradi Celsius per un giorno, una condizione di crescita stimolante per E. coli e il fago T7.

Le placche appariranno dopo uno o cinque giorni di incubazione, a seconda della specie batterica, delle condizioni di incubazione e della scelta del mezzo. Qui, le placche erano visibili dopo un giorno di incubazione a 37 gradi Celsius. Iniziare controllando le piastre contrassegnate control e assicurarsi che non si siano formate placche in queste piastre, poiché ciò indicherebbe una contaminazione virale. Per determinare il titolo di fago nel campione originale, iniziare con le piastre contenenti il campione di fago più diluito e contare le placche senza rimuovere i coperchi, contrassegnandoli per indicare quali sono già stati contati. Ripetere il conteggio per ogni piatto in ogni set. Alcune piastre potrebbero avere troppe o troppo poche placche da contare. Considera da 10 a 150 come un conteggio della placca ideale.

Quindi, generare una tabella che elenca i valori del numero di placca per le diverse diluizioni e repliche. Quindi, calcolare i valori medi del numero di placca per le piastre di diluizione che contenevano il numero ideale di conteggi di placca. In questo esempio, questi erano il numero medio di placche formate nel 10 al meno tre e 10 al meno quattro piastre di diluizione. Ora, regolare per fattore di diluizione fago dividendo i valori medi ottenuti placca per i rispettivi fattori di diluizione fago. Qui, il numero medio di placche formate da 10 a meno tre e da 10 a meno quattro piastre di diluizione, sono state divise per i rispettivi fattori di diluizione per ottenere il numero di unità di formazione della placca, o PFU, in 100 microlitri di miscela di fagi. Per convertire il valore in PFU per millilitro, moltiplicare i valori generati per 10, poiché solo 100 microlitri di miscela di diluizione dei fagi sono stati utilizzati durante la fase di preparazione della sovrapposizione di batteriofagi, producendo un fattore di diluizione aggiuntivo di 10. Infine, calcolare la media dei valori ottenuti dalle diverse piastre di diluizione. Questo darà il numero medio di PFU per millilitro. Il numero di PFU corrisponde al numero di particelle di fago infettivi nel campione originale.