Figura 7.2. Funzione di Rat1 nel meccanismo siluro di terminazione della trascrizione. (A) La trascrizione nascente di mRNA di Pol II è cotranscriptionally spaccata dal componente Ysh1 del fattore di specificità di poliadenilazione e di scissione (CPSF). L’estremità 5 ‘ monofosforilata esposta risultante dell’RNA a valle è un substrato per la rapida degradazione da parte di Rat1/Rai1, che era stato reclutato nel complesso Pol II tramite proteine Pcf11 e Rtt103 che interagivano con il CTD Ser2-fosforilato. Il complesso di allungamento viene destabilizzato quando Rat1 / Rai1 raggiunge la polimerasi. La terminazione dipendente da Rat1 è stimolata dall’elicasi Sen1 che interagisce con la subunità Rpb1 large Pol II e facilita il reclutamento di Rat1. (B) appena sintetizzato pre-rRNA è scisso cotranscriptionally dal Rnt1 endonucleasi e la conseguente 3’ prodotto è degradata da Rat1/Rai1, che siluri Pol I. efficiente Pol risoluzione anche richiede l’associazione di Nsi1 e/o Reb1 al T1 terminator (scatola verde), causando polimerasi, la sospensione, la Pol-specifiche subunità Rpa12 e elicasi Sen1, che associa con rDNA e interagisce direttamente con Rnt1. (Vedere la sezione color plate sul retro del libro.) L’efficiente terminazione Pol I richiede anche il legame di Nsi1 e/o Reb1 al terminatore T1 (green box), causando la pausa della polimerasi, la subunità specifica di Pol I Rpa12 e l’elicasi Sen1, che si associa a rDNA e interagisce direttamente con Rnt1.

Lavori successivi hanno rivelato che Rat1 nel lievito e Xrn2 nell’uomo erano responsabili dell’attività del siluro e che la mancanza di entrambi gli enzimi, così come l’attivatore Rat1 Rai1 nel lievito, porta a un difetto di terminazione, che si manifesta come un’estesa trascrizione letta. È anche possibile che un omologo della pianta Rat1, Arabidopsis AtXRN3, agisca come fattore di terminazione della trascrizione in modo simile a Rat1 / Xrn2. Gli approcci ad alto rendimento hanno rivelato un accumulo di trascritti non codificanti dall’estremità 3’dei geni mRNA e microRNA (miRNA) nel mutante di knockdown xrn3, che può corrispondere a molecole di lettura trascrizionale . Pertanto, AtXRN3 può partecipare a una sorveglianza globale di RNA 3 ‘ – end come risultato della sua attività di terminazione dei siluri.

Il meccanismo del siluro dipende dall’attività catalitica dell’esonucleasi di Rat1 e non solo dalla sua presenza . Il substrato di RNA monofosforilato per Rat1 / Xrn2 durante la sintesi dell’mRNA è generato come risultato di una scissione cotrascrizionale (CoTC) nel sito di poliadenilazione dal macchinario di formazione dell’mRNA 3′-end. Più precisamente, questo processo viene eseguito dal componente Ysh1 del CF II nel lievito o dalla corrispondente subunità CPSF-73 del fattore di specificità di scissione e poliadenilazione umana (CPSF) (rivisto in Ref. ). Sono stati proposti due fattori per contribuire alla terminazione efficiente: la forza del segnale di poli (A) e l’azione dell’esonucleasi degradano il prodotto di scissione 5′, che facilita la pausa della polimerasi a valle del sito di poli(A) e promuove il suo rilascio . D’altra parte, la terminazione dipendente da Rat1 compromessa non abolisce il corretto riconoscimento del sito di poli(A) e la scissione dell’mRNA .

Ulteriori siti di ingresso Rat1 / Xrn2 possono sorgere attraverso CoTC autocatalitico a valle del sito di poli(A) nei mammiferi o scissione endonucleolitica da Rnt1 nel lievito . Quest’ultimo caso è stato segnalato come un meccanismo di terminazione fail-safe per i geni codificanti proteine, che, insieme al percorso mediato dal complesso Nrd1/Nab3/Sen1 (NRD), fornisce una modalità di backup per il rilascio di Pol II.

Sebbene Rat1 / Xrn2 sia necessario per una terminazione Pol II efficiente, Rat1 non riesce a innescare la terminazione in vitro e la sua attività di degradazione 5′-3′ non è sufficiente a promuovere la dissociazione della polimerasi in vivo. Coerentemente, il lievito Xrn1 mirato al nucleo è in grado di degradare cotranscriptional dell’RNA nascente ma non salva i difetti di terminazione causati da una carenza di Rat1. Queste osservazioni suggeriscono che l’esonucleasi che raggiunge la polimerasi è necessaria ma non sufficiente per destabilizzare il complesso di allungamento e che un elemento aggiuntivo del meccanismo del siluro funziona durante la terminazione. È stato postulato che una caratteristica unica Rat1, il dominio tower esteso, non presente nelle proteine Xrn1, possa essere responsabile delle sue proprietà di terminazione . È concepibile che il dominio della torre subisca determinate modifiche o funga da interfaccia per le interazioni con fattori che migliorano la terminazione. Uno dei possibili candidati per fattori che stimolano la terminazione Rat1-dipendente è l’RNA elicasi Sen1, che è un componente chiave della via di terminazione per gli RNA non codificanti nel lievito (vedi sotto) che contribuisce anche alla terminazione dei geni codificanti proteine, con l’effetto più forte su MRNA più brevi . Sen1 interagisce tramite il suo dominio N-terminale con la più grande subunità Pol II, Rpb1 e compromettendo l’attività dell’elicasi Sen1 compromette la distribuzione Pol II a livello genomico su geni codificanti e non codificanti . È stato dimostrato che l’omologo umano Sen1, Senataxin, promuove direttamente la terminazione della trascrizione mediata da Xrn2 risolvendo gli ibridi RNA:DNA (R-loop) formati dietro il Pol II elongante, prevalentemente nei siti di pausa ricchi di G a valle del sito di poli(A). Questa attività facilita l’accesso di Xrn2 ai prodotti di scissione del sito 3′ di poli(A) e contribuisce quindi al reclutamento dell’esonucleasi siluro. Il modo di azione del lievito Sen1 è pensato per essere simile .

Una domanda senza risposta è come Rat1 viene reclutato per la polimerasi allungante. Diverse osservazioni supportano l’associazione Rat1 tramite proteine che interagiscono con il dominio C-terminale Pol II (CTD) attraverso il loro dominio CTD-interagente (CID), vale a dire la subunità Pcf11 del fattore di scissione del lievito IA (CFIA) e Rtt103 (regolatore della trasposizione Ty1 103). Rat1 e Rai1 sono presenti nelle regioni promotori e codificanti con un forte arricchimento alle estremità 3 ‘ dei geni. L’interazione funzionale tra Rat1 e Pcf11 è stata dimostrata per facilitare il reciproco corecruitment di entrambi i fattori: Rat1 collega la terminazione alla formazione 3′-end stimolando il reclutamento di fattori di elaborazione 3’-end, in particolare le subunità CFIA Pcf11 e Rna15, mentre Pcf11 contribuisce all’associazione Rat1 sul sito di poli(A). Inoltre, è stato dimostrato che Pcf11 umano migliora la degradazione dell’RNA nascente e promuove la terminazione della trascrizione . A sua volta, Rtt103, che associa anche vicino alle estremità 3’dei geni, copurifica con Rat1, Rai1 e Pcf11 e, insieme a Pcf11, riconosce in modo cooperativo il CTD Ser2-fosforilato del Pol II elongante . D’altra parte, la distribuzione Rat1 sui geni non è alterata in assenza di Rtt103 . Inoltre, Rat1 termina anche la trascrizione da parte di Pol I, che manca di un CTD, suggerendo che il reclutamento di Rat1 può avvenire anche attraverso altri meccanismi. In effetti, l’associazione di hXrn2 è stata segnalata come mediata da p54nrb / PFS (protein-associated splicing factor), che sono proteine multifunzionali coinvolte nella trascrizione, nello splicing e nella poliadenilazione . Il ruolo di p54nrb / PFS nella terminazione della trascrizione di Pol II è stato dimostrato anche in C. elegans.

Oltre agli MRNA, Pol II sintetizza una vasta gamma di trascrizioni non codificanti, tra cui piccoli RNA nucleari e SNORNA e una varietà di RNA instabili. Nel lievito, la trascrizione di queste specie relativamente brevi è terminata principalmente da un complesso NRD alternativo, composto dalle proteine leganti l’RNA Nrd1 e Nab3 e dall’elicasi ATP-dipendente Sen1 . Poiché questo meccanismo molto probabilmente non comporta una scissione endonucleolitica cotranscrizionale, è l’attività di srotolamento ibrido RNA:DNA Sen1 che si pensa sia essenziale per la dissociazione della polimerasi, forse in modo simile all’elicasi batterica Rho DNA-RNA. Rho probabilmente destabilizza il complesso di allungamento traslocando lungo e rimuovendo l’RNA nascente dalla polimerasi . Un modello alternativo allosterico ipotizza che Rho carichi sulla polimerasi e induca riarrangiamenti nel sito attivo dell’enzima nei siti di terminazione . Entrambe le modalità di azione potrebbero essere applicate per l’elicasi Sen1.

Sebbene il Rat1 sia reclutato per i geni snoRNA, in particolare quelli intronici, la terminazione NRD-dipendente delle trascrizioni di snoRNA non è compromessa quando manca, ed è stato, quindi, suggerito che partecipi ad alcuni eventi di terminazione prematura . È ancora possibile, tuttavia, che il meccanismo di siluro Rat1 possa contribuire alla terminazione della trascrizione di snoRNAs, come U3 o snR40, il cui 3′-end viene rilasciato dalla scissione Rnt1 che espone il restante nascente trascrizione 5′-end per l’attacco Rat1 .