informazioni Cliniche
Un 25-anno-vecchio uomo Cinese (IV-1) sposata con un non-consanguinei donna con cromosomi normali (IV-2). Questa coppia ha avuto un figlio (V-1) che è morto a 6 mesi senza un’autopsia. L’analisi cromosomica precedente indicava che V-1 aveva un cariotipo 45,XY,der(14;15)(q10;q10). I genitori del propositus (IV-1) sono cugini di primo grado fenotipicamente normali (III-1, III -2). I loro genitori, uno zio reciproco ed entrambi i nonni non erano disponibili per l’analisi citogenetica (Fig. 1). L’esame di stato mentale è stato eseguito su IV – 1 da uno psichiatra.
Analisi del cariotipo
Ibridazione in situ di fluorescenza (FISH)
I cromosomi spermatici del paziente III-1 e IV-1 sono stati analizzati da FISH. I campioni di sperma sono stati valutati per volume, concentrazione e motilità secondo i criteri dell’Organizzazione mondiale della Sanità. Dopo l’analisi dello sperma, lo sperma progressivamente mobile è stato isolato e lavato due volte in soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7.4) e centrifugato a 1500 giri / min per 11 min. I pellet sono stati fissati con 5 ml di miscela di acido acetico/metanolo (1:3) per almeno 30 min a 4 °C. Aliquote (40-50 µl) della sospensione risultante di nuclei sono state spalmate su vetrini pre-puliti a freddo. La decondensazione dei nuclei è stata eseguita in 1 N NaOH per 2 min. I vetrini sono stati poi degradati da una serie di etanolo graduato(70 %, 90 %, 100 %) e denaturato con formammide allo 0,25% in 2xSSC seguito da ibridazione notturna con una combinazione di sonde disponibili in commercio. In questo studio sono stati utilizzati due set di miscele di sonda. Il PESCE bicolore è stato effettuato utilizzando sonde locusspecific (LSP) e sonde Tel di Vysis (Vysis, Downers Grove, IL, USA). Per il paziente IV-1 e III-1, la sonda TelVysion 14q(D14S1420, Spettro rosso) è stata utilizzata per 14q32.33 e la sonda TelVysion 15q (D15S120, Spettro verde) è stata utilizzata per 15q26.3.
Per studiare la presenza di effetti intercromosomiali, il pesce a triplo colore è stato eseguito utilizzando la seconda miscela di sonda, che consiste in sonde satellitari commerciali (DNA) da Vysis, inclusi i cromosomi 18, X e Y (CEP 18, Spectrum Blue/CEP X, Spectrum Green/CEP Y, Spectrum Red). I lavaggi post-ibridazione includevano 2 min in 0,4 xSSC/0,3% NP-40 (pH = 7) a 72 °C, seguiti da 1 min in 2xSSC/0,1% NP-40 (pH = 7) a temperatura ambiente. I vetrini sono stati coperti con DAPI II (Vysis). Sono stati segnati solo spermatozoi intatti con un grado simile di decondensazione e chiari segnali di ibridazione. Tutti gli spermatozoi interrotti o sovrapposti sono stati esclusi dall’analisi. Sono state analizzate diapositive con efficienza di ibridazione del 99% e oltre. sono stati analizzati 1.000 nuclei di spermatozoi per paziente.
Ibridazione genomica comparativa di matrice (aCGH)
L’ibridazione genomica comparativa di matrice (aCGH) è stata introdotta nella diagnosi clinica per individuare rapidamente i guadagni e le perdite genomewide con più alta risoluzione . È un metodo ad alto throughput che rileva le modifiche al numero di copia con una risoluzione di 1 Kb. Per l’analisi aCGH, il DNA è stato estratto dal sangue periferico . L’analisi aCGH è stata eseguita utilizzando gli array commerciali 8 × 60 K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
Analisi dei dati
L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il sistema SAS (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC). Il test del Chi-quadrato è stato utilizzato per l’analisi della segregazione meiotica. Un valore di probabilità inferiore a 0,05 (P < 0,05) è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
L’analisi del cariotipo è stata eseguita su quattro membri della famiglia e ha rilevato due diversi cariotipi di traslocazione robertsoniana. I risultati sono mostrati di seguito. III – 1 e III-2 erano eterozigoti mentre IV-1 era omozigote.
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III-1: 45,XY,der(14;15)(q10;q10)
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III-2: 45,XX,der(14;15)(q10;q10)
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IV-1: 44,XY,der(14;15)(q10;q10), der(14;15)(q10;q10)
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IV-2: 46,XX
Perché il paziente (IV-1) è un sintomo di apatia, di cui abbiamo parlato a lui di vedere uno psichiatra per un approfondito esame dello stato mentale. Il paziente non aveva una storia psichiatrica ed è rimasto cooperativo durante l’intervista psichiatrica. I suoi processi di pensiero erano lineari, logici, e costantemente obiettivo diretto e il suo giudizio era intatto. Pertanto, non sono stati osservati sintomi psichiatrici. Inoltre, la consultazione neurologica non ha rivelato deficit neurologici focali. I risultati della tomografia computerizzata craniocerebrale (CT) e della puntura lombare (LP) erano normali. L’elettroencefalografia (EEG) non ha mostrato segni di attività convulsiva.
L’analisi aCGH su IV-1 ha rilevato una duplicazione di 2,03 Mb nella regione di q11.1-q11.2 sul cromosoma 15 (Fig. 3). Secondo il Copy number variation database (CNVdb), questa duplicazione è un polimorfismo cromosomico nella popolazione normale. Poiché IV-1 è un vettore di traslocazione Robertsoniana omologa e i suoi due cromosomi derivati provenivano dallo stesso vettore di traslocazione Robertsoniana, abbiamo ipotizzato che ciascuno dei due cromosomi derivati dovrebbe avere una duplicazione di 2,03 Mb nella regione di q11.1-q11.2 sul cromosoma 15.
L’analisi aCGH di IV-1 ha rivelato una duplicazione di 2,03 Mb sul cromosoma 15 q11.1-q11.2 (arr 15q11.1q11.2 (20,481,702-22,509,254) x4)
Per analizzare lo sperma di III-1 e IV-1, sono stati valutati campioni di sperma dai due diversi portatori di traslocazione Robertsoniana (III-1 e IV-1) per volume, concentrazione e motilità secondo i criteri dell’Organizzazione Mondiale della Sanità. Il volume, la concentrazione e la mobilità dello sperma in III-1 sono significativamente ridotti a causa della sua vecchiaia. Al contrario, sono tutti normali in IV – 1 (Tabella 1). Abbiamo ulteriormente analizzato i modelli di segregazione meiotica in questi due diversi portatori di traslocazione robertsoniana. Nel vettore di traslocazione robertsoniano eterozigote (III-1), la frequenza degli spermatozoi normali/bilanciati derivanti dalla segregazione alternativa era del 79,9% mentre la frequenza degli spermatozoi sbilanciati derivanti dalla segregazione adiacente era del 20,1 %, che è significativamente più alta della popolazione normale (Tabella 2). Al contrario, nella traslocazione dell’omozigote Robertsonian (IV-1), la frequenza degli spermatozoi bilanciati era del 99,7% mentre la frequenza degli spermatozoi sbilanciati era solo dello 0,3%, che è simile alle popolazioni normali (Tabella 2). Questi dati hanno dimostrato che quasi tutti gli spermatozoi degli omozigoti di traslocazione Robertsoniana erano bilanciati mentre quelli degli eterozigoti avevano una percentuale di sbilanciati. Inoltre, l’analisi cromosomica dello sperma di IV-1 ha mostrato un cariotipo 22,X,der (14;15) o 22,Y, der(14;15) a sostegno della nostra speculazione. Come mostrato in Fig. 4, la freccia indicò uno sperma con quattro segnali di fluorescenza(due rossi e due verdi) suggerendo che questo sperma ha due cromosomi derivati di der (14;15). Questi dati suggeriscono un potenziale meccanismo di speciazione nell’uomo attraverso la traslocazione robertsoniana.
Spermatozoi dopo ibridazione con TelVysion 14q32.33 (Spettro rosso) e TelVysion 15q26.3 (Spettro verde). Lo sperma con freccia rossa può essere uno sperma diploide
L’influenza dei cromosomi traslocati sulle sinapsi e la disgiunzione di altri cromosomi è chiamata effetto intercromosomiale (ICE) . Per determinare se l’ICE fosse presente, i tassi di nullisomia, disomia e diploide per i cromosomi 18, X e Y sono stati analizzati in entrambi i portatori di traslocazione robertsoniana (Tabella 3). Nel vettore di traslocazione robertsoniano eterozigote (III-1), c’è stato un aumento significativo del tasso di aneuploidia e diploide del cromosoma sessuale. Al contrario, nella traslocazione omozigote Robertsoniana (IV-1), l’incidenza di spermatozoi con nullisomia, disomia e diploide per i cromosomi sessuali è rimasta simile alle popolazioni normali (Tabella 3). Questi dati suggeriscono che il GHIACCIO si presenta solo in alcuni portatori di traslocazione robertsoniana.
Discussione
Rob traslocazione porta sono fenotipicamente normali, in quanto comporta solo la perdita del braccio corto di materiale. Sono noti molti di questi riarrangiamenti in popolazioni naturali di specie diverse. I riarrangiamenti robertsoniani possono aumentare i polimorfismi in una specie, fornire materiale per la selezione naturale e persino portare alla speciazione . È stato sostenuto che i tipi di riarrangiamenti cromosomici che si verificano come polimorfismi o come eterozigoti permanenti fissi coinvolgono invariabilmente cromosomi meta-o submetacentrici. Quelli che distinguono le specie e servono a isolare queste specie coinvolgono cromosomi telocentrici o acrocentrici, che sono auto-sterilizzanti . Nel nostro studio, IV-1, che è un vettore di traslocazione Robertsoniana omologa, era sano e aveva un complemento cromosomico equilibrato. La valutazione di un campione di sperma da ha mostrato la morfologia e la motilità normali dello sperma. Ancora più importante, 99.il 7% del suo sperma è normale o bilanciato (Tabella 2) e non vi è stato alcun effetto intercromosomiale (Tabella 3).
Il PESCE multicolore su nuclei spermatici decondensati consente una rapida analisi della segregazione meiotica negli spermatozoi dei portatori di traslocazione, fornendo informazioni sulla quantità esatta di sperma normale / bilanciato . Tali informazioni sono indubbiamente importanti non solo per la ricerca citogenetica di base, ma anche per la consulenza riproduttiva dei portatori di traslocazione robertsoniana. t(14;15) sono rare traslocazioni robertsoniane. I nostri dati hanno confermato studi precedenti che dimostrano che la segregazione alternativa era più frequente delle segregazioni adiacenti nei portatori di traslocazioni robertsoniane . Tuttavia, i modelli di segregazione meiotica e gli effetti intercromosomiali in due portatori di traslocazione robertsoniani sono diversi (Tabella 2). Questi risultati sono coerenti con i dati pubblicati in precedenza . L’alta prevalenza della segregazione alternativa è presumibilmente dovuta alla configurazione cis del trivalente durante la meiosi, che favorisce una segregazione alternativa in tutte le traslocazioni robertsoniane . Sebbene un vettore di traslocazione Robertsoniano abbia un complemento genetico completo, la loro forma produttiva è ridotta a causa dell’alta probabilità di gameti geneticamente squilibrati.
L’effetto intercromosomiale potrebbe essere spiegato dalla formazione di eterosinapsi tra i cromosomi coinvolti nella traslocazione e la vescicola sessuale, che potrebbe coinvolgere anche altri cromosomi . Il GHIACCIO rimane controverso in letteratura. Alcune pubblicazioni hanno indicato la sua presenza con traslocazione robertsoniana, mentre altri non hanno dimostrato alcuna prova di questo fenomeno . Nel nostro studio, abbiamo osservato una maggiore incidenza di aneuploidia per i cromosomi sessuali negli spermatozoi nella traslocazione eterozigote Robertsoniana ma non nella traslocazione omozigote Robertsoniana suggerendo che il GHIACCIO si presenta solo in alcuni portatori di traslocazione Robertsoniana.
I riarrangiamenti robertsoniani sono cambiamenti cromosomici comuni che possono portare a un rapido ed efficiente isolamento riproduttivo tra popolazioni cariotipicamente simili, specialmente quando molti cromosomi metacentrici robertsoniani mostrano omologie monobrachiali . Le traslocazioni robertsoniane omozigoti sono state segnalate da diversi gruppi e revisionate sistemicamente dal gruppo O’Neill . Dalapiccola et al. riportato un feto con due cromosomi t(14;21). I genitori correlati erano eterozigoti per la stessa traslocazione. Martinez et al. riportato tre fratelli adulti omozigoti per t(13;14). I loro genitori erano cugini di primo grado ed entrambi erano portatori eterozigoti. Il suo nome è Raj trovato un cariotipo DS unico 45, XY, der(14;21)pat, der(14;21)mat, +21mat. Sebbene l’eterozigosità della traslocazione sia associata a disturbi meiotici, che porteranno alla sterilità e alla sottofecundità, non dovrebbe avere alcun effetto sulla meiosi. Qui abbiamo riportato un uomo con un 44,XY,der(14;15)(q10;q10), der(14;15)(q10;q10) cariotipo. La traslocazione robertsoniana può fornire materiale per l’evoluzione. L’isolamento a lungo termine di un gruppo di individui omozigoti per un particolare cromosoma di traslocazione robertsoniana potrebbe teoricamente portare alla creazione di una nuova sottospecie umana con un complemento genetico completo in 44 cromosomi. Sebbene le differenze cariotipiche tra le specie siano state a lungo riconosciute, la questione se queste mutazioni giochino un ruolo causale nella speciazione rimane senza risposta . Nel nostro studio, tutti gli spermatozoi degli omozigoti di traslocazione robertsoniana erano bilanciati mentre quelli degli eterozigoti avevano una percentuale di quelli sbilanciati che implicavano un potenziale di omozigosi delle traslocazioni Robertsoniane per speciazione.