Vijf Personen-6 varianten en hun expressie patronen in squid embryo ’s en volwassen oog weefsels

We deden een enkele 3′-RACE PCR voor de pygmee inktvis Pax-6-gen (aangeduid als IpPax-6) om te onderzoeken wat de splicing varianten en meerdere loci van Pax-6 in coleoid koppotigen. We vonden dat er geen meerdere loci waren in de pygmee inktvis, maar we identificeerden drie Pax-6 varianten van discrete lengtes. Verschillen in de aminozuursequenties onder deze pax-6 varianten werden beperkt tot beperkte gebieden. Daarom werden ze verondersteld het resultaat te zijn van alternatieve splitsingsgebeurtenissen van een enkele locus. Vervolgens valideerden we de aanwezigheid van splicingvarianten met behulp van RT-PCR en uiteindelijk verkregen we vijf soorten splicingvarianten, waaronder een schijnbare ortholog van authentieke Pax-6 (figuur 1). De lengte en structuur van authentieke IpPax-6 waren vergelijkbaar met die van de pax-6 genen gevonden in andere inktvissoorten, Euprymna scolopes en Loligo pealei15,16. Authentic ippax-6 (authentic form, 499 aa) bestaat uit twee onafhankelijke DNA-bindende domeinen, de PD-en HD-domeinen en een C-terminal P/S/T-rich domain (PST), dat is de toegewijde activator met een partner trans-activator eiwit, zoals getoond in veel dieren (figuur 1). Zowel de gelijkenis van de eiwitvolgorde als de fylogenetische boom bevestigden dat IpPax-6 een ortholog was van vliegoog en gewervelde pax-4/6 (aanvullend figuur 1). De vier geïdentificeerde varianten produceerden eiwitten met een lengte die verschilde van die van authentieke IpPax-6 (figuur 1).

om de stadiumspecifieke expressie van de squid Pax-6-varianten te onderzoeken, hebben we Q-PCR uitgevoerd voor verschillende weefsels en in verschillende embryonale stadia met behulp van primers die zijn ontworpen om de extra exonen van IpPax-6 aan te pakken (Figuur 2 & figuur S2). Inktviseieren vertonen epibolische gastrulatie en directe ontwikkeling zonder typische larvestadia van weekdieren 17. Embryonale ogen verschijnen uit de uitwendige epiderm van de blastodisc en zijn differentieerbaar na Stadium 18, met retinale pigmentatie vanaf Stadium 20. De lens verschijnt als een transparante staalachtige structuur zichtbaar voor het blote oog op stap 25. We eerst uitgevoerd Q-PCR met behulp van primers gericht exon 2, die alle vijf varianten omvat. De Q-PCR-analyse toonde aan dat IpPax-6 werd uitgedrukt in Stadium 16 voorafgaand aan de vorming van de oogblaasjes (figuur 2A). De expressieintensiteit van IpPax-6 werd geleidelijk verhoogd met de ontwikkeling van het pijlinktembryo (figuur 2A), waarbij de oogbol de hoogste expressieintensiteit van de geteste weefsels vertoonde. Zoals waargenomen bij de andere bilaterische dieren, werden de authentieke en variant vormen van IpPax-6 uitgedrukt op duidelijk verlaagde niveaus in het spierweefsel. Vervolgens gebruikten we primers gericht op varianten zonder exon 4 (varianten 1 en 3, figuur 2B). De primers detecteerden varianten 1 en 3 op lage niveaus in de embryo ‘ s in Stadium 16 en in het oogbol Weefsel. We gebruikten ook primers gericht op varianten, waaronder exon 6 (varianten 2 en 3, figuur 2C). De Q-PCR-analyse toonde aan dat varianten 2 en 3 werden uitgedrukt in de oogbollen en optische kwabben en in embryo ‘ s in stadia 16 en 25. Aangezien de vorming van photoreceptorcellen en de lens in embryo ‘ s in stadium 25 begint, kunnen de varianten met inbegrip van exon 6 tot oogontwikkeling bijdragen. De resultaten tonen aan dat de expressiepatronen van de ippax-6 varianten aanzienlijk verschilden van die van authentieke IpPax-6.

om te onderscheiden welke varianten aanwezig zijn in elke fase, hebben we RT-PCR uitgevoerd met behulp van primer sets over exon grenzen. Variant 1 werd geacht in alle/enkele embryonale stadia tot uitdrukking te komen, maar niet in de volwassen ogen (aanvullend figuur 2). RT-PCR-analyse toonde ook aan dat variant 4 sterk tot uiting kwam in de volwassen ogen, met name in het netvlies, maar niet in de lenzen (aanvullende figuur 2A). Varianten 2 en 3 werden uitgedrukt in alle embryonale stadia en ook in volwassen weefsels (aanvullend figuur 2B).

om de weefselspecifieke expressie van ippax-6-varianten te identificeren, hebben we in situ hybridisatie uitgevoerd met behulp van RNA–sondes die speciaal zijn ontworpen om aan elke variant te binden (figuur 2D-G). De RNA-sonde die van exon 2 wordt ontworpen richt zich op alle vijf varianten die in deze studie worden geà dentificeerd. De RNA-sonde die van exon 4 wordt ontworpen gebonden aan de authentieke vorm en aan varianten 2 en 4. IpPax-6 werd gevonden te worden gelokaliseerd in het hersengebied, met inbegrip van de dorsale basale kwab, superieure frontale kwab, stengel/olfactorische kwab en optische kwab (figuur 2D–G), zoals beschreven in Hartmann et al.18 het weefsel buiten het netvlies (misschien overeenkomend met de toekomstige iridofoorlaag) drukte ook duidelijk IpPax-6 uit in Stadium 22 (figuren 2D en 2D’). Ippax-6 expressie werd waargenomen in deze laag tot stadium 25. De kruising in situ die de sonde gebruiken die exon 4 richten stelde voor dat de varianten 2 en 4 gelijkaardige uitdrukkingspatronen in de hersenen maar niet in de ogen hadden (figuur 2E). Deze bevinding suggereert dat varianten 1 en 3 (zonder exon 4) zijn upregulated in de buitenste laag van de ogen. Deze gevolgen impliceren dat elke ippax-6 variant onafhankelijk wordt geregeld over de processen van oogvorming.

Exon-intron structuur van Pax-6 in andere koppotigen/weekdieren

we hebben onderzocht of dit type alternatieve splicing alleen werd verkregen bij coleoïde koppotigen. Het toepassen van RT – PCR analyse op Japanse speer inktvis (Loligo bleekeri) embryonale RNAs, vonden we drie soorten mRNAs mogelijk afgeleid van alternatieve splicing (exon 4 overslaan, exon 3 insertion en exon 6 insertion) in de ogen (figuur 3A, B). De ingevoegde exons 3 en 6 codeerden respectievelijk 20 en 40 aminozuren, terwijl de overgeslagen exon 4 51 aminozuren codeerde. Om de aanwezigheid van soortgelijke alternatieve splicing in andere molluscan genomen te onderzoeken, onderzochten we de exon-intron structuren van Pax-6 in de owl limpet en pearl oyster. De volledige genoomsequentie van de uil limpet (Lottia gigantea, verkregen uit JGI genome portal Lotgi v1. 0, e_gw1. 86.103.1)19 en van de pareloester (Pinctada fucata, verkregen uit de Oist Marine Genomics Unit genome browser P. fucata_ver1.0, transcript: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, scaffold8418.1) 20 toonde aan dat molluscan Pax-6 vijf exons heeft. Exon 4 in de pijlinktvis werd bewaard bij de geteste weekdieren. Exons 3 en 5 werden echter niet gevonden in het pareloester pax-6-Gen. Zo vonden we dat variant vormen 2 en 4 zijn verworven in de coleoïde koppotigen (figuur 1).

voor zover wij weten, is onze studie de eerste die in-frame splicing varianten van squid Pax-6 rapporteert die verschillend werden uitgedrukt naargelang het embryonale stadium. Eerdere studies geïsoleerde discrete types van splicing varianten die de N-terminale helft van het PD domein in andere pijlinktvis species had verloren 15,18, maar deze varianten toonden geen spatio-temporele verschillen in expressie. Onze studie stelde ook voor dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verwerving van variaties in pax-6 transcripten door alternatieve splicing uniek zijn verworven in de coleoïde cephalopod lijn, aangezien de lagere weekdieren, zoals tweekleppigen, geen overeenkomstig exon-achtig fragment in hun genomen bezitten.

functie van squid Pax-6 varianten en hun vermeende rol in oogontwikkeling

toevoeging en deletie van een aminozuurfragment gecodeerd in de alternatief gebruikte exonen zal naar verwachting structurele veranderingen in de ippax-6 eiwitvarianten veroorzaken, die hun functie in het ontwikkelingsproces kunnen veranderen. Twee van zijn varianten (varianten 1 en 3) ontbreken een 153mer in het midden van authentieke Pax-6 en de helft van de HD (figuur 1). Om te onderzoeken of de deletie hun functionele eigenschappen beïnvloedt, hebben we driedimensionale (3D) structurele voorspellingen van de eiwitten uitgevoerd op basis van vergelijkende modellering. De vermeende 3D-structuren van de HDS van authentieke ippax-6 en de variant zonder het segment gecodeerd door exon 3 werden geconstrueerd. De template structuur werd geïdentificeerd door DNA-gebonden vorm zodat we de structuur van IpPax-6 en de variant in DNA-gebonden vorm konden voorspellen. De vermeende 3D-structuur van de authentieke vorm was redelijk goed gemodelleerd; de kernresten, namelijk Phe op de lus vóór de eerste helix van de HD, Leu op de eerste helix, Leu op de tweede helix en Trp en Phe op de derde helix van de modelstructuur, werden behouden en de drie helices van de HD waren blijkbaar stevig in elkaar samengepakt (figuur 3C). De residuen die belangrijk zijn voor de DNA-binding, namelijk twee Arg-residuen aan de n-eindarm en polaire residuen op het oppervlak van de derde helix, werden redelijk dicht bij de DNA-interface geplaatst (figuur 3C, D). De vermeende 3D-structuur van de variant leverde echter een aantal problematische kwesties op. In de gemodelleerde structuur werd het verlies van het gebied gecodeerd door exon 3, dat het n-terminale deel van de eerste helix codeert, gecompenseerd door 15 residuen gecodeerd in exon 2. Aldus, verschilden de aminozuuropeenvolgingen van de authentieke en variant vormen slechts in het gebied dat de 15 residuen van de n-eindzijde bevatten. Dit verschil, echter, aanzienlijk verhoogd de structurele energie van de variant en blijkbaar destabiliseerde de totale structuur. Deze instabiliteit kan het gevolg zijn van een gebrek aan de Phe op de lus vóór de eerste helix en van de Leu op de eerste helix. Deze componenten zijn blijkbaar belangrijk voor het verpakken van de drie helices. Bovendien ontbraken twee arg-residuen bij de n-eindlijn die aan de basissen van DNA in de minder belangrijke groef in de authentieke vorm binden in de variant. Deze problemen in stabiliteit en DNA binding in de variant suggereren sterk dat de HD van de variant onstabiel is en dat het domein weinig bindingsaffiniteit heeft voor DNA (figuren 3D en 3D’). Het ontbreken van een stabiele HD suggereert verder dat varianten 1 en 3 verschillende DNA-doelplaatsen hebben van dat van authentieke IpPax-6 in pijlinktvissoorten.

twee varianten (varianten 2 en 3) vertoonden ook een 120 Mer insertion binnen het PST domein (figuur 1). De ingevoegde sequentie bleek specifiek te zijn voor pijlinktvis (Figuur 2). Deze invoeging kan de trans-activatie-activiteiten van het PST-domein wijzigen. Variant 4 toonde een unieke invoeging (57 mer) tussen de PD en HD. Het Motif-programma (http://www.genome.jp/tools/motif/) vond geen bekende domeinen of handtekeningen in de ingevoegde reeks. Deze invoeging verlengt een linker tussen de PD en HD domeinen.