HPV/P16-positieve en-negatieve HNSCC tonen verschillen in betrokkenheid van de knooppunten
we bepaalden de HPV-en p16-status van 241 patiënten met plaveiselcelcarcinoom (OPC) behandeld met (chemo)bestraling (C)RT. De menselijke tumormonsters werden verkregen volgens protocollen goedgekeurd door de ethische Raad van de Universitaire Ziekenhuizen Leuven (Leuven, België) en impliciete toestemming van alle patiënten werd verkregen. Clinicopathologische gegevens werden uit patiëntkaarten gehaald en de gemiddelde follow-uptijd was 4,19 jaar. HPV-positieve patiënten werden gekarakteriseerd door lagere t-stadia met 45% (26 van de 58; p = 0,025) van de HPV-positieve patiënten die T1/2-Stadium tumoren vertoonden, terwijl dit 29% (51 van de 175; p = 0,025) was in de HPV-negatieve groep. Bovendien vertoonden HPV-positieve tumoren significant hoger (p = 0.014) betrokkenheid van knooppunten bij 72% (42 van de 58) van de HPV-positieve patiënten met N2/N3-tumoren, terwijl dit slechts 54% (95 van de 175) was in de HPV-negatieve groep. Hoewel de relatie tussen de P16-status en het n-stadium niet significant was, werd een trend naar hogere betrokkenheid van de knooppunten en P16-positiviteit gezien. Drieënzestig % van de P16-positieve patiënten vertoonde N2/N3-tumoren, terwijl dit slechts 54% was in de P16-negatieve groep (Tabel 1). Deze resultaten zijn in overeenstemming met andere studies, waaruit blijkt dat HPV-positieve hnscc-patiënten hogere n-en lagere t-stadia hebben .
zoals verwacht resulteerden lage T-stadia in betere percentages voor verre controle (DC) met 5-jaars controlepercentages van 83% en 70% (p = 0,04) voor T1/T2 en T3/4 tumoren respectievelijk (extra bestand 1: figuur S1A). N2 / 3 tumoren (5-jaar DC 70%; p = 0,02) toonde een hoger risico op falen op afstand in vergelijking met N0/1 tumoren (5-jaar DC tarief 85%; p = 0,02) (aanvullend dossier 1: Figuur S1B). Er werd geen statistisch significant verschil gezien in DC-percentage tussen HPV-positieve en negatieve ziekte (5-jaars DC-percentage van 82% versus 5-jaars DC-percentage van 72% respectievelijk; p = 0,20) (aanvullend dossier 1: Figuur S1C). Hoewel niet significant, dit 10% verschil in DC-tarieven suggereert invloed van het virus buiten lokale tumorcontrole. Bovendien wijst het op de aanwezigheid van verschillende verspreidingspatronen tussen HPV-positieve en-negatieve HNSCC.
P16 onderdrukt de invasie – en migratiecapaciteit van HPV-positieve hnscc
om het moleculaire mechanisme achter deze potentiële verschillen in metastase in onze patiëntencohort te onderzoeken, hebben we de in vitro migratie-en invasiecapaciteit van hnscc-cellen beoordeeld. HPV / P16-positieve SCC154-en SCC104-cellen vertoonden een significant lagere migratiegraad dan HPV / P16-negatieve sqd9 -, CAL27-en SC263-cellen (Fig. 1 bis). In overeenstemming met de migratie assay, HPV/P16 positieve cellen toonden verminderde invasiemogelijkheden in vergelijking met de HPV/P16 negatieve cellen (Fig. 1 ter).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). d Invasiecapaciteit van HPV-positieve SCC154-cellen behandeld met shRNA voor p16 (shp16) en controle (shluc). (A-d) het resultaat wordt weergegeven als gemiddelde ± SEM van drie experimenten en p-waarden worden berekend door middel van tweezijdige t-test
het tumorsuppressor p16 is een bekende celcyclusregulator en een goede surrogaatmarker voor HPV-positieve HNSCC . Bovendien schrijven recente gegevens een bredere rol toe aan p16, waaronder een rol in migratie en onderdrukking van angiogenese . Daarom onderzochten we ook de invloed van p16 op de migratie-en invasiecapaciteit van HPV-positieve SCC154 cellen gemanipuleerd met korte haarspeld RNA (shRNA) voor p16 (shp16) en control shRNA (shluc). Downregulation van P16 uitdrukking verhoogde migratie en invasie capaciteit van de scc154 cellen (Fig. 1c en d). Deze gegevens verifiëren de aanwezigheid van verschillen in verspreidingspatronen tussen HPV-positieve en-negatieve HNSCC en suggereren een actieve rol van p16 in de gemetastaseerde cascade.
P16 onderdrukt migratie en invasie door angiogenese bij HPV-positieve HNSCC
Het is algemeen bekend dat angiogenese, die actief wordt gehandhaafd in kankercellen door pro-angiogene factoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA), een kanaal is voor de verspreiding en metastase van kankercellen en agressieve tumorprogressie bevordert . Bovendien is de negatieve correlatie tussen HPV/p16 en VEGFA eerder beschreven in HNSCC . Daarom hebben we de relatie tussen HPV, p16 en VEGFA in onze patiëntencohort beoordeeld. HPV-positieve patiënten vertoonden significant lagere VEGFA-expressie: 54% (28 van de 51) van de patiënten vertoonde geen of lage VEGFA-expressie vergeleken met 32% (53 van de 161) in de HPV-negatieve groep (Tabel 2). Hoewel de negatieve correlatie tussen VEGFA en p16 minder uitgesproken was, werd een trend naar significantie waargenomen (Tabel 2).
we onderzochten verder het verband tussen angiogenese en p16 met in vivo xenotransplantaten geïnjecteerd met SCC154 HPV-positieve cellen gemanipuleerd met shp16 of shluc. Een hoger aantal bloedvaten werd ontdekt in muizen tumoren met lage P16 expressie in vergelijking met controle tumoren (Fig. 2 bis). Bovendien, resulteerde de verhoging van vascularisatie in lagere necrose, hoger aantal mitotische cellen en de groeivoordeel van shp16 die tumors uitdrukken (aanvullend dossier 2: Figuur S2A-C). We konden de betrokkenheid van p16 bij onderdrukking van metastase in vivo niet verifiëren vanwege de afwezigheid van een gemetastaseerd diermodel. Nochtans, kunnen het de groeivoordeel en de verhoogde vascularisatie gezien in shp16 muizen tumors het frequente voorkomen van geavanceerde t stadia in HPV negatieve hnscc patiënten verklaren.
dubbele rol van p16 in de verspreiding van HNSCC. een bloedvatvorming in scc154 shp16 en SCC154 shluc xenotransplantaatmuismodellen beoordeeld door middel van CD31-kleuring (boven de grafiek); n = 5. b gemiddeld aantal lymfevaatvorming in scc154 shp16 en SCC154 shluc xenotransplantaatmuismodellen beoordeeld door Lyve-1 kleuring( boven de grafiek); n = 5. c gemiddelde score van alpha4 beta1 integrine kleuring in SCC154 shp16 en SCC154 shluc muis xenotransplantaat modellen; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-d, P-waarden worden berekend door de tweezijdige t-test
p16 stimuleert lymphangiogenesis en knooppunten verspreid in de HPV-positieve HNSCC
Deze resultaten nog steeds niet verklaren het ontstaan van de vergelijkbare verre van recidief in HPV/p16 positief en negatief HNSCC patiënten en zeker niet op het uitleggen van de zeer significante associatie tussen HPV positiviteit en betrokkenheid lymfklieren beschreven in onze en diverse andere studies . Dit is vooral belangrijk omdat het de aanwezigheid van een hoog lokaal metastatisch potentieel in HPV-positieve HNSCC impliceert. Interessant is dat de lymphangiogenese, zoals angiogenese, tumor metastase bevordert door de groei van nieuwe lymfatische schepen binnen de tumor te veroorzaken en door celhandel aan lymfeklieren te verbeteren. Bovendien wordt de verhoogde lymfevatdichtheid in tumoren geassocieerd met verhoogde metastase aan lymfeklieren. . Daarom beoordeelden we de vorming van lymfevaten door homoloog lymfevaat hyaluronan (LYVE-1) immunostaining in shluc en shp16 muizen tumoren. We vonden dat P16 suppressie resulteerde in een lagere lymfevaat dichtheid in HPV / P16 positieve xenografts suggereren een dubbele rol van p16 in metastase (Fig. 2b).
om de functie van p16 te begrijpen, hebben we ons gericht op integrines aangezien deze eiwitten worden geaccepteerd als belangrijke regulatoren van angiogenese en lymphangiogenese . Bovendien is de band van P16 aan integrins en het verlies van uitgespreide cel eerder gedocumenteerd . Integrines zoals alpha4 bèta 1 zijn belangrijke modulatoren van lymphangiogenese . Daarom beoordeelden we de aanwezigheid van alpha4 beta1 integrine in scc154 shluc en SCC154 shp16 muizen tumoren. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).