bacteriofagen, ook wel Fagen genoemd, zijn virussen die specifiek bacteriën infecteren en we kunnen hun aanwezigheid bevestigen en kwantificeren met behulp van een tool genaamd de plaque assay. Bacteriofagen infecteren hun vatbare gastheren door zich eerst aan de bacteriële celwand te hechten en hun genetisch materiaal in te spuiten. Dan kapen ze de biosynthetische machines van de cel om hun DNA te repliceren en talrijke nageslacht faagdeeltjes te produceren, die ze dan vrijgeven door lysing en het doden van de gastheercel.
Deze lytische activiteit is de basis van een veelgebruikte faagtelling techniek die bekend staat als de plaque assay of double agar layer assay. Hier wordt eerst een bacteriofaagmengsel bereid in een gesmolten voedingsbouillon met een lage concentratie agar. Alle bacteriën die in de mix moeten leven en actief te delen in de log fase van hun groei, die ervoor zal zorgen dat een groot percentage van de bacteriën zijn levensvatbaar en in staat om een dichte gazon rond de plaques te vormen. Vervolgens wordt deze gesmolten bacteriefaag-agar-mix verspreid over een meer vast, geconcentreerd voedingsmedium van agar dat al gestold is op een petrischaal. Bij incubatie bij kamertemperatuur stolt de lage concentratie agar-faag-bacteriebouillon ook tot een zachte agar-overlay.
hier kunnen de bacteriecellen extra voedingsstoffen uit de onderste laag halen en moeten ze zich snel vermenigvuldigen om een samenvloeiend gazon van bacteriën te produceren. Nochtans, aangezien de faagdeeltjes ook in de zachte laag aanwezig zijn, zullen deze hun genetisch materiaal binnen de bacteriën besmetten en herhalen, die in cellysis culmineren, die veelvoudige Nakomelingen vrijgeeft. Deze faag Nakomelingen infecteren dan de naburige cellen, aangezien de semi-vaste staat van de bacteriën-faag laag hun beweging beperkt tot meer ver gelegen gastheercellen. Deze cyclus van infectie en lysis gaat verder over meerdere rondes, het doden van een groot aantal bacteriën in een gelokaliseerd gebied. Het effect van de naburige cellen die worden vernietigd, is om een enkele cirkelvormige heldere zone te produceren, een plaque genaamd, die met het blote oog kan worden gezien, waardoor de bacteriële lytische activiteit van de faag effectief wordt versterkt en hun opsomming mogelijk wordt.
Het aantal plaques op een petrischaal wordt Plaquevormende eenheden of PFUs genoemd en moet, mits de aanvankelijke bacteriofaagconcentratie voldoende verdund was, rechtstreeks overeenkomen met het aantal infectieuze faagdeeltjes in het oorspronkelijke monster. Deze techniek kan ook voor karakterisering van plaquemorfologie worden gebruikt, om in Identificatie van faagtypes te helpen, of om faagmutanten te isoleren. In dit lab leer je hoe je de plaque assay kunt uitvoeren voor het opsommen van fagen, met als voorbeeld de T7 Fagen van E. coli.
identificeer eerst een geschikt medium voor het kweken van de bacteriële gastheercellen en de bacteriofaag. Hier werd lysogeny bouillon, of lb medium, gebruikt om E. coli en de T7 faag te kweken. Neem vervolgens drie schone glazen flessen en label ze met media, naam, en dan de eerste als LB-bouillon, de tweede als LB-Bottom Agar, en de derde als LB-Top Agar. Weeg nu vier gram voorgeformuleerd lb poeder in drie sets en breng dan een set van gewogen gedroogde media in elke fles. Voeg 200 ml water toe aan de eerste fles. Meng de inhoud met een magnetische roerstaaf.breng vervolgens met een pH-meter en constant roeren de uiteindelijke pH op 7,4 door toevoeging van natriumhydroxide of zoutzuur. Herhaal de watertoevoeging en pH-aanpassing voor de andere twee resterende flessen, ook. Weeg nu drie gram agar poeder en voeg het toe aan de tweede fles om een 1,5% bodem agar te maken. Ten slotte, weeg 1. 2 gram agar en voeg het toe aan de derde fles om de .6% lb top agar. De bouillon conditie in de fles heeft men geen agar toevoeging nodig. Sluit de fles half strak en steriliseer vervolgens de media door 20 minuten bij 121 graden Celsius te autoclaveren. Eenmaal voltooid, verwijder de mediaflessen uit de autoclaaf en draai onmiddellijk de doppen van de fles om ze volledig te sluiten om besmetting te voorkomen. Houd de lb-bouillon en Lb-Top agar media op de bank voor later gebruik. Plaats de lb-Bottom Agar om af te koelen in een waterbad dat is ingesteld op ongeveer 45 graden Celsius.
wanneer de lb-bodem agar ongeveer 45 graden Celsius bereikt, breng deze over op de werkbank. Steriliseer vervolgens de werkruimte met 70% ethenol. Voeg vervolgens 450 microliters steriel één molair calciumchloride toe aan de gesmolten bodemagar om een uiteindelijke concentratie van 2 te maken.25 millimeter. Draai de fles voorzichtig om te mengen. Vervolgens, zet zeven schone Petrischalen. Label elk gerecht aan de onderkant met de medianaam en bereidingsdatum. Giet vervolgens 15 milliliter van de onderste agar in elk van de zeven petrischaaltjes. Laat de platen enkele uren of ‘ s nachts bij kamertemperatuur instellen. Eenmaal ingesteld kunnen de kweekplaten indien nodig meerdere dagen op vier graden Celsius worden bewaard, ondersteboven om condensatie te minimaliseren. Breng de Petrischalen van de koelkast van 4 graden Celsius naar een incubator van 37 graden Celsius één uur voor de test.
de dag voordat de test wordt voorgevormd, moet de E. coli worden gekweekt. Hier werden 10 microliters van E. coli cultuur ingeënt in 10 milliliter LB-bouillon. Plaats de bacteriën om ‘ s nachts te groeien in een schuddende incubator ingesteld op 37 graden Celsius bij 160 RPM. Verwijder vervolgens op de dag van de test de bacteriecultuur uit de incubator. Zaad een verse 10 milliliter verse lb bouillon met 0,5 milliliter van de nacht cultuur. Plaats deze cellen om te groeien tot een schudden incubator ingesteld op 37 graden Celsius bij 160 RPM. Vervolgens, gebruik een spectrofotometer om te controleren wanneer deze cultuur log fase groei bereikt, aangegeven door een optische dichtheid van 0,5 tot 0,7. Zodra de OD dit niveau bereikt, stop de incubatie door de celcultuur naar de bank over te brengen. Ze zijn nu klaar om te worden gebruikt voor phage overlay assay.
Faagtiters kunnen exponentieel variëren tussen verschillende faagtypen en monsters. Dus om ze effectief te tellen, moeten ze worden verdund om een breed scala aan faagconcentraties te genereren. Op de dag van de analyse, genereren een reeks van faag verdunningen variërend van een tiende tot een miljoenste concentraties, na een 10-voudige verdunningstechniek. Voer de seriële verdunning in drievoud uit om statistisch significante en nauwkeurige gegevens te verkrijgen.
smelt vervolgens de gestolde LB-top agar met behulp van een magnetron. Plaats het vervolgens een uur lang in een waterbad dat vooraf is ingesteld op 45 graden Celsius. Verzamel na een uur de petrischaaltjes met de onderste agarlaag uit de incubator. Label de platen met faagconcentratie en testdatum. Dan, zet zeven schone reageerbuisjes. Label elke reageerbuis met het seriële faagverdunningsnummer en wijs er één aan als controlemiddel.
wanneer de LB-top agar 45 graden Celsius bereikt, breng deze over op de werkbank. Voeg 450 microliters van één molair calciumchloride toe aan de 200 milliliter agar om een uiteindelijke concentratie van 2,25 millimeter te maken. Draai de fles voorzichtig om te mengen. Voeg vervolgens 35 milliliter lb-top agar en vier milliliter bacteriële suspensie aan een steriele conische buis. Draai voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen, maar vermijd schudden om schuimvorming te voorkomen.
meng nu vijf milliliter van deze bacterie-topagar in elk van de zeven reageerbuisjes. Breng dan 100 microliters van de serieel verdunde bacteriofaagsteekproeven en controlemedia over, die eenvoudig media zonder bacteriofaag zouden moeten zijn, aan de respectvol geëtiketteerde reageerbuizen. Draai het mengsel voorzichtig om te zorgen voor een goede menging. Breng voorzichtig vijf milliliter bacteriofaagmengsel over op de respectievelijke petrischaal. Verdeel het mengsel gelijkmatig over het gehele oppervlak door de petrischaal voorzichtig rond te draaien.
zodra alle Petrischalen met het mengsel zijn gelaagd, de bovenste laag stollen door gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Na voltooiing van deze stappen, herhaal het proces voor de tweede en vervolgens de derde sets van de petrischaaltjes met behulp van de resterende twee sets van faagverdunningen. Sluit elke schaal af met parafilm en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de kweekplaat ondersteboven op een geschikte temperatuur gedurende 24 uur of totdat er plaques ontstaan. Hier werden platen één dag in een incubator van 37 graden Celsius geplaatst, een stimulerende groeivoorwaarde voor E. coli en de T7 faag.
Plaques verschijnen na een tot vijf dagen incubatie, afhankelijk van de bacteriesoort, incubatieomstandigheden en de keuze van het medium. Hier waren plaques zichtbaar na één dag incubatie bij 37 graden Celsius. Begin met het controleren van de platen gemarkeerd controle en zorg ervoor dat er geen plaques werden gevormd in deze platen, omdat dit zou wijzen op virale besmetting. Om de faagtiter in het oorspronkelijke monster te bepalen, begint u eerst met de platen met het meest verdunde faagmonster en telt u de plaques zonder de deksels te verwijderen en markeert u deze om aan te geven welke al zijn geteld. Herhaal het tellen voor elke plaat in elke set. Sommige platen kunnen te veel of te weinig platen bevatten om te tellen. Beschouw 10 tot 150 als een ideale plaquetentelling.
genereer vervolgens een tabel met de plaquenummerwaarden voor de verschillende verdunningen en replicaten. Bereken vervolgens de gemiddelde plaquegetalwaarden voor de verdunningsplaten die het ideale aantal plaquegetallen bevatten. In dit voorbeeld was dit het gemiddelde aantal plaques gevormd in de 10 tot de -3 en 10 tot de -4 verdunningsplaten. Pas nu de faagverdunningsfactor aan door de verkregen gemiddelde plaquewaarden te delen door de respectieve faagverdunningsfactoren. Hier werd het gemiddelde aantal plaques gevormd tot de 10 tot de min drie en 10 tot de min Vier verdunningsplaten gedeeld door hun respectieve verdunningsfactoren om het aantal plaquevormende eenheden, of PFU ‘ s, in 100 microliter faagmengsel te verkrijgen. Om de waarde om te zetten in PFU per milliliter, vermenigvuldig de gegenereerde waarden met 10, aangezien tijdens de bacteriofaagoverlayvoorbereidingsstap slechts 100 microliter van het faagverdunningsmengsel werd gebruikt, waardoor een extra verdunningsfactor van 10 werd verkregen. Bereken ten slotte het gemiddelde van de waarden die uit de verschillende verdunningsplaten zijn verkregen. Dit geeft het gemiddelde aantal PFU ‘ s per milliliter. Het aantal PFUs komt overeen met het aantal infectieuze faagdeeltjes in het oorspronkelijke monster.