Abstract

Oogtroost, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), is een geneeskrachtige plant die traditioneel in Europa wordt gebruikt voor de behandeling van verschillende gezondheidsstoornissen, vooral als oogwater voor de behandeling van oogaandoeningen zoals conjunctivitis en blefaritis die geassocieerd kunnen worden met bacteriële infecties. Van sommige Euphrasia-soorten is eerder gemeld dat ze etherische olie bevatten. De samenstelling en bioactiviteit van E. rostkoviana olie zijn echter onbekend. Daarom hebben we in deze studie de chemische samenstelling en antimicrobiële activiteit van de etherische olie van de ogentroost onderzocht tegen sommige organismen geassocieerd met ooginfecties: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa en Candida albicans. De analyse van GC-lidstaten onthulde meer dan 70 bestanddelen, met n-hexadecaanzuur (18,47%) als hoofdbestanddeel gevolgd door thymol (7,97%), myristinezuur (4,71%), linalool (4,65%), en anethool (4,09%). De etherische olie vertoonde een antimicrobieel effect tegen alle geteste organismen met uitzondering van P. aeruginosa. De beste activiteit werd waargenomen tegen alle geteste Grampositieve bacteriën met de minimale remmende concentraties van 512 µg / mL. Dit is het eerste rapport over de chemische samenstelling van etherische olie van E. rostkoviana en de antimicrobiële werking ervan.

1. Inleiding

Oogtroost, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), wordt in Europa al eeuwenlang gebruikt als een traditioneel geneesmiddel voor de behandeling van verschillende ziekten. Afkooksels en infusies van bloeiende bovengrondse delen worden gebruikt tegen droge hoest, heesheid, symptomatische behandeling van koude, oorpijn, en hoofdpijn, hooikoorts, etterende huidlaesie, of catarrale ziekten van het darmkanaal, maar vooral als oogwater te behandelen en te voorkomen oogaandoeningen zoals conjunctivitis, blefaritis, vermoeidheid van de ogen, etterende oculaire ontsteking, en sties . Het gebruik van ogentroost thee is ook gemeld in etnoveterinary geneeskunde voor koeoog infectie behandeling . Ondanks eeuwen van het traditionele gebruik voor de behandeling van oogaandoeningen, is er slechts één prospectieve cohortstudie uitgevoerd die de werkzaamheid van Euphrasia oogdruppels bij de behandeling van conjunctivitis bevestigt en een enkele klinische studie die het effect van lokale toepassing van de oogdruppels op antibioticaconsumptie bij pasgeborenen onderzoekt . Bovendien is het spectrum van antimicrobiële werking volledig onbekend tot de recente rapporten over de anticandidale en antibacteriële werking van sommige Euphrasia-extracten.

het therapeutisch effect van E. rostkoviana kan voornamelijk worden toegeschreven aan zijn antioxidant, ontstekingsremmende en antimicrobiële activiteit . Van de stoffen die eerder zijn geïdentificeerd in extracten van E. rostkoviana kunnen apigenine , luteoline, kaempferol, quercetine, cafeïnezuur, cumarinezuur en rosmarinezuur verantwoordelijk zijn voor de antimicrobiële werking. Hoewel de aanwezigheid van etherische olie (EO) in E. officinalis L. en E. stricta Kunt eerder is gemeld, zijn de samenstelling en bioactiviteit van de E. rostkoviana EO onbekend. Daarom bestudeerden we in deze studie de chemische samenstelling en antimicrobiële activiteit van het oogtroost EO tegen het paneel van drie Gram-positieve bacteriën (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus en S. epidermidis) en drie Gram-negatieve bacteriën (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae en Pseudomonas aeruginosa), en één gist (Candida albicans), organismen die gewoonlijk geassocieerd worden met ooginfecties.

2. Materiaal en methoden

2.1. Chemische stoffen en plantaardig materiaal

de authentieke normen borneol, kamfer, carvacrol, carvon, caryofylleen, p-cymeen, estragol, eucalyptol, limoneen, linalool, menthol, Menthon, β-myrceen, γ-terpineen en thymol voor de identificatie van de EO-componenten, alsmede de controleantibiotica ciprofloxacine en tioconazol werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Praag, Tsjechië). Hexaan (Merck, Praag, Tsjechië), dimethylsulfoxide (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Tsjechië) en Tween 80 (Sigma-Aldrich, Praag, Tsjechië) werden gebruikt als oplosmiddelen. Het plantaardige materiaal dat Voor de EO-distillatie werd gebruikt, werd gekocht bij commerciële bronnen (F-DENTAL, Hodonín, Tsjechië). De EO werd geëxtraheerd door hydrodistillatie met behulp van Clevenger-apparatuur.

2.2. Chemische analyse van de EO met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)

De E. rostkoviana EO werd geanalyseerd door GC-MS met behulp van Agilent 7890A GC gekoppeld aan Agilent 5975C single-quadrupole massa detector uitgerust met een HP-5ms kolom (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm film) van Agilent (Santa Clara, CA, USA). Hexaan werd als oplosmiddel gebruikt en het monstervolume van 1 µL werd in split-modus (verhouding 20 : 1) in de tot 250°C verwarmde injector geïnjecteerd.de uitgangstemperatuur van de oven werd gedurende 3 minuten op 60°C ingesteld, geprogrammeerd op 230°C met een snelheid van 3°C/min, en vervolgens gedurende 10 minuten constant gehouden. Helium werd gebruikt als draaggas met een debiet van 1 mL/min. De MS-analyse werd uitgevoerd in full-scan-modus en de elektronenionisatie-energie werd ingesteld op 70 eV. De identificatie van individuele componenten was gebaseerd op de vergelijking van hun massaspectra en relatieve retentie-indices met de National Institute of Standards and Technology Library (NIST, USA) en literatuur , evenals co-Injection van authentieke standaard.

2.3. Bacteriestammen en kweekmedia

De standaardstammen van drie Gram-positieve bacteriën Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 en S. epidermidis ATCC 12228, drie gramnegatieve bacteriën Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, en Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, en één gist Candida albicans ATCC 10231 werden verkregen uit Oxoïde (Basingstoke, Verenigd Koninkrijk). Kation aangepaste Mueller-Hinton bouillon (MHB) en Sabouraud dextrose bouillon (SDB) werden gebruikt als teeltmedium voor antibacteriële en antischimmel microdilutie assay, respectievelijk, en werden geëquilibreerd met Tris-gebufferde zoutoplossing (Sigma-Aldrich, Praag, Tsjechië). Mueller-Hinton agar (MHA) en Sabouraud dextrose agar (SDA) werden gebruikt voor de daaropvolgende bepaling van respectievelijk bactericide en fungicide concentraties. Alle media werden gekocht bij Oxoid (Basingstoke, Verenigd Koninkrijk).

2.4. Bepaling van de Minimum Inhibitory Concentration (mic)

De Mic ‘ s werden bepaald met behulp van de in vitro microdilutiemethode voor bouillon volgens de richtlijnen van het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), gewijzigd volgens de aanbevelingen die worden voorgesteld voor een effectieve beoordeling van het infectiewerend potentieel van natuurlijke producten met 96-wells microtiterplaten. Kort, EO werd opgelost in DMSO met toevoeging van Tween 80 en twee-voudige seriële verdunningen werden bereid in MHB voor bacteriën en in SDB voor de gist terwijl de geteste concentraties varieerden van 4 tot 2048 µg/mL. Het entmateriaal werd bereid uit nachtculturen zodat de initiële CFU-concentraties in de microplaten respectievelijk 5 × 105 en 2 × 103 CFU/mL voor bacteriën en gist waren. De geïnoculeerde platen werden onderzocht na 24 uur incubatie bij 35°C en opnieuw na 48 uur bij C. albicans. De microbiële groei werd spectrofotometrisch gemeten door Multiscan Ascent microplaat fotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) bij 405 nm. MICs werden uitgedrukt als de laagste concentraties die ≥ 80% van de bacteriegroei konden remmen in vergelijking met de positieve groeicontrole. De experimenten werden uitgevoerd in drievoud in drie onafhankelijke tests en mediane waarden werden gebruikt voor MICs berekening. Vanwege de recent gerapporteerde mogelijkheid van invloed van EO vluchtige componenten op de microbiële groei in aangrenzende putten , werden positieve groeicontrolerijen ingevoegd tussen de EO verdunningsrijen om eventuele groeiinvloed te detecteren. De gebruikte oplosmiddelen remde de bacteriegroei niet bij geteste concentraties. Ciprofloxacine en tioconazol werden gebruikt als referentieantibiotica voor respectievelijk bacteriën en gist.

2.5. Bepaling van de minimale bactericide concentratie (MBC) en de minimale fungicide concentratie(MFC)

De aliquots van 20 µL werden vanuit elk putje zonder microbiële groei overgebracht naar de MHA-platen (SDA-platen voor C. albicans) na respectievelijk 24 uur en 48 uur incubatie van bacteriën en gist. De platen werden vervolgens gedurende 24 uur bij 35°C geïncubeerd. de MBC en MFC werden beoordeeld als ≥99,9% afname van CFU in vergelijking met entmateriaal, alle uitgevoerd in drievoud in drie onafhankelijke tests.

3. Resultaten en discussie

3.1. Chemische karakterisering van oliën en bioactieve fracties bestanddelen

de EO-hydrodistillatie door Clevenger-achtige apparaten leverde 0,02% (m/v) geelbruine olie op die bij kamertemperatuur lijkt te stollen, wat waarschijnlijk wordt veroorzaakt door een hoog gehalte aan vetzuren (32,23% in totaal). GC-MS analyse van de EO bleek de aanwezigheid van meer dan 70 bestanddelen, met palmitinezuur (18,47%) de meest voorkomende component gevolgd door thymol (7,97%), myristinezuur (4,71%), linalool (4,65%), anethool (4,09%), linoleenzuur (3,81%), hexahydrofarnesylaceton (3,16%), laurinezuur (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.

figuur 1

kenmerkend chromatogram van etherische olie Euphrasia rostkoviana. De belangrijkste componenten worden geëtiketteerd volgens de volgorde van hun retentietijden. (12) Linalool; (22) α-terpineol; (34) anethool; (36) thymol; (37) carvacrol; (58) laurinezuur; (66) myristinezuur; (67) hexahydrofarnesylaceton; (70) palmitinezuur; (73) linoleenzuur.

het hoge gehalte aan vetzuren is eerder gevonden in de E. stricta EO (25,7% in totaal), ook met het hoogste percentage palmitinezuur (20,3%) en myristinezuur (3,9%) . Er is echter geen andere verbinding aanwezig in significante hoeveelheid die zou wijzen op de verwantschap van deze twee Euphrasia soorten.

3.2. Antimicrobiële activiteit

De E. rostkoviana EO vertoonde activiteit tegen zes van de zeven organismen die werden getest met MICs variërend van 512 tot 2048 µg/mL. De grampositieve bacteriën waren gevoeliger dan de gramnegatieve en de gist, terwijl P. aeruginosa het enige organisme was dat niet werd geremd door de olie bij de hoogste geteste concentraties. De MICs, MBC ’s en MFC’ s van de EO tegen alle geteste micro-organismen zijn samengevat in Tabel 2. De actieve concentraties zijn vergelijkbaar met die welke eerder werden gerapporteerd voor bijvoorbeeld Eos van Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum of Thymus vulgaris, vooral in het geval van anticandidale activiteit . De olie was ook effectiever dan E. rostkoviana-extracten die door Teixeira en Silva werden getest tegen E. coli, E. faecalis, S. aureus en S. epidermidis. De MICs van de referentieantibiotica tegen de bacteriën en gist gevoelig voor E. rostkoviana EO waren in overeenstemming met respectievelijk de aanvaardbare clsi-grenswaarden en eerdere rapporten .

Microorganism Euphrasia rostkoviana EO CIP TIO MIC (µg/mL) IC50 (µg/mL) MBC/MFC (µg/mL) MIC (µg/mL) MIC (µg/mL) 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 24 h 48 h Enterococcus faecalis 512 — 128 — 1024 0.5 — Staphylococcus aureus 512 — 128 — >2048 0.5 — Staphylococcus epidermidis 512 — 256 — >2048 0.25 — Klebsiella pneumoniae 2048 — 1024 — >2048 0.125 — Escherichia coli 2048 — 1024 — >2048 0.015 — Pseudomonas aeruginosa >2048 — >2048 — >2048 0.125 — Candida albicans 128 1024 128 1024 2048 — 0.063

The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration.

Table 2

The inhibitory and cidal concentrations of E. rostkoviana essential oil.

aangezien het gehalte aan het belangrijkste EO-bestanddeel palmitinezuur niet hoger is dan 20% en er meer dan 10 andere antimicrobieel actieve verbindingen zijn, variërend van 1 tot 8%, is het moeilijk om de belangrijkste stoffen te suggereren die verantwoordelijk zijn voor het E. rostkoviana EO-antimicrobieel effect. Palmitinezuur is eerder geïdentificeerd als de belangrijkste verbinding van fracties actief tegen Gram-negatieve, maar niet Gram-positieve bacteriën . Aan de andere kant is bekend dat verzadigde vetzuren met een middellange keten en onverzadigde vetzuren met een lange keten vooral Grampositieve bacteriën remmen . Bovendien oefent laurinezuur ook Activiteit uit tegen een aantal schimmels . De antimicrobiële activiteit van de EO is dus waarschijnlijk te wijten aan een complexe werking van de antimicrobiële vetzuren met de andere bekende antimicrobiële verbindingen geïdentificeerd in de EO zoals anethool, borneol, kamfer, carvacrol, linalool, menthol, α-terpineol of thymol.

4. Conclusies

concluderend bleek uit de chemische analyse een aantal antimicrobieel werkzame stoffen aanwezig in de E. rostkoviana EO en zijn antifungale en antibacteriële activiteit tegen zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën werd bevestigd. Voor zover wij weten is dit het eerste rapport over de samenstelling en antimicrobiële activiteit van E. rostkoviana EO.

belangenconflict

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door de Europese Stichting voor Wetenschap en het Tsjechische ministerie van Onderwijs, Jeugd en sport Project CZ.1.07/2.3.00/30.0040; door de S-subsidie van het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en sport van de Tsjechische Republiek; en door de Tsjechische universiteit voor Life Sciences Praag Project iga 20155012. De auteurs zijn Slavka Barlakova dankbaar voor het Engels proeflezen.