4.2.1 Polymerase II

hoewel transcriptiebeëindiging veel minder is onderzocht dan de initiatie ervan, is de afgelopen 25 jaar gebleken dat de goed getimede en nauwkeurige afgifte van de ontluikende transcript-en RNA-polymerasen uit het DNA-sjabloon cruciaal is voor het lot van het RNA en voor het algehele genoomonderhoud.

Later onderzoek toonde aan dat Rat1 in gist en Xrn2 bij mensen verantwoordelijk waren voor de torpedo-activiteit en dat gebrek aan beide enzymen, evenals de Rat1 activator Rai1 in gist, leidt tot een terminatiedefect, dat zich manifesteert als een uitgebreide transcriptie read-through. Het is ook mogelijk dat een plant rat1 homoloog, Arabidopsis AtXRN3, fungeert als een transcriptie beëindiging factor vergelijkbaar met Rat1/Xrn2. Hoog-productiebenaderingen openbaarden een accumulatie van noncoding transcripten van 3′-eind van mRNA en microRNA (miRNA) genen in de xrn3 knockdown mutant, die aan transcriptional read-through molecules kan corresponderen . Aldus, kan AtXRN3 aan een globaal RNA 3′-eind toezicht als resultaat van zijn torpedo beëindigingsactiviteit deelnemen.

het torpedomechanisme hangt af van de exonuclease katalytische activiteit van Rat1, en niet alleen van de aanwezigheid ervan . Het monofosforyleerde RNA-substraat voor Rat1 / Xrn2 tijdens de mRNA-synthese wordt gegenereerd als gevolg van een cotranscriptionele splitsing (CoTC) op de polyadenylatieplaats door de mRNA 3′-end-vormingsmachines. Meer precies, dit proces wordt uitgevoerd door de ysh1 component van de CF II in gist of de overeenkomstige cpsf-73 subeenheid van de menselijke splitsing en polyadenylatie specificiteit factor (Cpsf) (beoordeeld in Ref. ). Er werden twee factoren voorgesteld om bij te dragen tot een efficiënte beëindiging: de sterkte van het poly(A) – signaal en de werking van de exonuclease die het 5′ – splitsingsproduct afbreekt, waardoor het pauzeren van de polymerase stroomafwaarts van de poly(A) – locatie wordt vergemakkelijkt en de afgifte ervan wordt bevorderd . Aan de andere kant schaft een verminderde Rat1-afhankelijke beëindiging de juiste poly(A)-site herkenning en mRNA splitsing niet af .

extra Rat1 / Xrn2-ingangsplaatsen kunnen ontstaan door autokatalytische CoTC stroomafwaarts van de poly(A) – locatie bij zoogdieren of endonucleolytische splitsing door Rnt1 in gist . Dit laatste geval werd gemeld als een faalveilig terminatiemechanisme voor eiwitcoderende genen, dat, samen met de route die wordt gemedieerd door het nrd1/Nab3/Sen1 complex (NRD), een back-upmodus biedt voor de afgifte van Pol II.

hoewel Rat1 / Xrn2 vereist is voor een efficiënte Pol II-beëindiging, kan Rat1 in vitro geen terminatie veroorzaken en is de 5′-3′ – degradatieactiviteit niet voldoende om de polymerase-dissociatie in vivo te bevorderen. Consequent, gist xrn1 gericht op de kern is geschikt voor de cotranscriptional degradatie van ontluikend RNA maar redt beëindigingsdefecten veroorzaakt door een Rat1 deficiëntie. Deze waarnemingen suggereren dat de exonuclease inhaalslag met de polymerase noodzakelijk is, maar niet voldoende om het elongatiecomplex te destabiliseren, en dat een extra element van het torpedomechanisme werkt tijdens de beëindiging. Men heeft gepostuleerd dat een unieke eigenschap van Rat1, het uitgebreide torendomein, niet huidig in de proteã nen van Xrn1, van zijn beëindigingseigenschappen kan de oorzaak zijn . Het is denkbaar dat het torendomein bepaalde wijzigingen ondergaat of dient als interface voor interacties met terminatiebevorderende factoren. Een van de mogelijke kandidaten voor factoren die Rat1-afhankelijke beëindiging bevorderen is de helicase Sen1 van RNA, die een belangrijke component van de beëindigingsweg voor noncoding RNAs in gist is (zie hieronder) die ook tot de beëindiging van eiwit-coderende genen, met het sterkste effect op kortere mRNAs bijdraagt . Sen1 interageert via zijn n-terminaal domein met de grootste Pol II subeenheid, rpb1 en het aantasten van Sen1 helicase activiteit belemmert genoom-brede Pol II distributie over codering en noncoding genen . De menselijke Sen1-homoloog, Senataxin, bleek de xrn2-gemedieerde transcriptiebeëindiging direct te bevorderen door de RNA-hybriden van DNA (R-loops) op te lossen die achter de verlengde Pol II worden gevormd, hoofdzakelijk op G-rijke pauzeplaatsen stroomafwaarts van de poly(A) plaats . Deze activiteit vergemakkelijkt de toegang van Xrn2 tot Poly (a) site 3′ splitsingsproducten en draagt aldus bij tot de rekrutering van de torpedo-exonuclease. Het werkingsmechanisme van gist Sen1 wordt geacht vergelijkbaar te zijn .

een onbeantwoorde vraag is hoe Rat1 wordt gerekruteerd voor de elongerende polymerase. Verschillende observaties ondersteunen Rat1 associatie via eiwitten die interageren met het Pol II C-terminaldomein (CTD) via hun CTD-interagerende domein (CID), namelijk de pcf11 subeenheid van de gist splitsingsfactor IA (CFIA) en Rtt103 (regulator van Ty1 transpositie 103). Rat1 en Rai1 zijn aanwezig bij de promotors en codeergebieden met een sterke verrijking aan de 3′-einden van genen. De functionele interactie tussen Rat1 en Pcf11 bleek de wederzijdse corecruitment van beide factoren te vergemakkelijken: Rat1 koppelt de beëindiging aan de 3 ‘- end vorming door het stimuleren van de rekrutering van 3′-end verwerkingsfactoren, met name de CFIA subeenheden Pcf11 en Rna15, terwijl Pcf11 bijdraagt aan Rat1 associatie over de poly(A) site . Ook, werd menselijke Pcf11 getoond om degradatie van ontluikend RNA te verbeteren en transcriptiebeëindiging te bevorderen . Op zijn beurt, rtt103, die ook dichtbij de 3’-einden van genen associeert, copurificeert met Rat1, Rai1, en Pcf11, en samen met Pcf11 samenwerkend erkent Ser2-phosphorylated CTD van de verlengde Pol II . Aan de andere kant, wordt de verdeling van Rat1 over genen niet veranderd in afwezigheid van Rtt103 . Daarnaast beëindigt Rat1 ook transcriptie door Pol I, die een CTD mist, wat suggereert dat rat1 rekrutering ook via andere mechanismen kan plaatsvinden. Inderdaad, werd de Vereniging van hXrn2 gemeld om door p54nrb/PFS (eiwit-geassocieerde splicing factor) te worden gemedieerd, die multifunctionele proteã nen betrokken bij transcriptie, splicing, en polyadenylation zijn . De rol van p54nrb/PFS in pol II transcriptiebeëindiging werd ook aangetoond in C. elegans.naast mRNAs synthetiseert Pol II een breed scala aan niet-coderende transcripties, waaronder kleine nucleaire RNAs en snoRNAs en een verscheidenheid aan onstabiele RNAs. In gist, wordt de transcriptie van deze relatief korte species hoofdzakelijk beëindigd door een alternatief NRD complex, samengesteld uit de RNA-Bindende proteã nen Nrd1 en Nab3 en de ATP-afhankelijke helicase Sen1 . Aangezien dit mechanisme hoogstwaarschijnlijk geen cotranscriptionele endonucleolytische splitsing met zich meebrengt , is het de Sen1 RNA:DNA hybride-afwikkelingsactiviteit die essentieel wordt geacht voor polymerase dissociatie, misschien op een manier die vergelijkbaar is met bacteriële Rho DNA–RNA helicase. Rho destabiliseert waarschijnlijk het elongatiecomplex door het transloceren en verwijderen van het ontluikende RNA uit de polymerase . Een alternatief, allosteric model stelt dat Rho ladingen op polymerase en herschikkingen in de enzym actieve plaats bij beëindigingsplaatsen induceert . Beide werkingsmodi kunnen goed van toepassing zijn voor Sen1 helicase.

hoewel Rat1 wordt gerekruteerd voor snornagenen, in het bijzonder intronische genen, is de NRD-afhankelijke beëindiging van snorna transcripten niet verminderd wanneer het ontbreekt, en daarom werd gesuggereerd dat het deelneemt aan een aantal vroegtijdige beëindiging gebeurtenissen . Het is echter nog steeds mogelijk dat het rat1 torpedo mechanisme kan bijdragen aan transcriptie beëindiging van snoRNAs, zoals U3 of snR40, waarvan 3′-einde wordt vrijgegeven door Rnt1 splitsing die de resterende ontluikende transcript 5′-einde voor Rat1 aanval blootstelt .verrassend genoeg bleek Rat1 colokaliseren met Pcf11 bij telomeren en bij de Pol III-getranscribeerde tRNA -, 5S rRNA-en SCR1-genen . De functionele betekenis van deze waarnemingen is momenteel onduidelijk, maar alternatieve beëindigingswijzen van deze RNAs, en de degradatie van afwijkende transcripten of de verwerking van onstabiele noncoding RNAs, zoals telomeric TERRA , zijn een mogelijkheid (tabel 7.1).