Cytopathic effect (CPE): hoe komen virussen weg met moord

virussen zijn per definitie onzichtbaar voor onze ogen. Het zijn nanostructuren die alleen zichtbaar kunnen worden met behulp van elektronenmicroscopie, een techniek die tijdrovend is en niet voor iedereen toegankelijk is. Als gevolg daarvan moet een viroloog alternatieven vinden om te kunnen werken en het object van belang te bestuderen. Een praktische manier om een virale infectie te” zien ” en indirect te meten is door te kijken naar de schade die een virus aan een cel veroorzaakt. Dit lijden of schade is bekend als cytofatisch effect (CPE) en de meting ervan wordt veel gebruikt in virologielaboratoria over de hele wereld.

CPE is een zeer fundamentele benadering om te begrijpen hoe een virus een cel infecteert, maar dat betekent niet dat het alleen wordt gebruikt in fundamenteel wetenschappelijk onderzoek. Het meten van CPE ‘ s kan ook een zeer nuttige uitlezing zijn voor farmaceutische bedrijven en diagnostische laboratoria.

Wat is een virus-geïnduceerd cytofatisch effect?

virussen zijn parasieten die een gastheercel nodig hebben om zich te vermenigvuldigen. Eenmaal in de cel, kapen ze de cellulaire machines om zijn eigen eiwitten, nucleïnezuur en membraan te produceren (wanneer nodig).

omdat het virus cellulaire factoren bezet die anders door de cel worden gebruikt, kan de replicatie ervan de basisfuncties van de gastheercellen veranderen of zelfs vernietigen. De reeks celveranderingen of veranderingen als gevolg van een virale besmetting staan bekend als CPEs. Dit zijn gewoonlijk negatieve veranderingen die structurele, metabolische of functionele wijzigingen in de cel kunnen veroorzaken die wordt besmet. Na verloop van tijd kan CPEs leiden tot de pathologische effecten van het virus (de ziekte).

klassieke voorbeelden van het cytopathische effect

een bekende virus-geïnduceerde CPE is celdood (bekijk een video van een stervende cel in ). Vele virussen doden cellen of door lysis of door apoptose te veroorzaken. Bijvoorbeeld, is HIV gekend voor het doden van CD4 + T-lymfocyten, die de belangrijkste reden is waarom Besmette individuen immunocompromised worden.

in het laboratorium is een eenvoudige manier om een muggencellijn (zoals C6/36) of Verocellen te doden door deze te infecteren met een bekend arbovirus, zoals Chikungunya, Dengue of Zika. Na een paar dagen van infectie vallen de cellen gewoon uit elkaar recht voor uw ogen (Fig. 1).

figuur 1 | VERO-cellen waren geïnfecteerd met het zikavirus. Na 72 uur infectie, is een duidelijke CPE duidelijk door de aanwezigheid van cel debri als gevolg van celdood.

een ander voorbeeld van CPE is syncytia-vorming. De cellen die door omhulde virussen worden besmet drukken virale proteã nen op hun plasmamembraan uit, die door virussen worden gebruikt om fusie met de gastheercel te bemiddelen. Wanneer deze virale proteã nen aan receptoren op het oppervlak van naburige cellen binden, vindt cel–cel fusie plaats, resulterend in syncytia vorming (multinucleated reuzencel).

respiratoir syncytieel virus (RSV) is de belangrijkste oorzaak van virale pneumonie bij jonge kinderen. De naam is afgeleid van het feit dat het syncytia kan vormen in celcultuur, maar opmerkelijk genoeg ook in de longen van geïnfecteerde patiënten.

CPE-gerelateerde veranderingen in celmorfologie omvatten ook afronding, losmaken en/of klonteren van adherente cellen. In dit geval blijven geïnfecteerde cellen metabolisch actief om het virus te repliceren, maar hun cytoskelet is veranderd. De morfologische veranderingen kunnen worden verklaard door een down-regulatie van de uitdrukking van de proteã nen van de oppervlakteadhesie als resultaat van besmetting. Het ebolavirus, bijvoorbeeld, is gekend om dramatische morfologische veranderingen in adherente cellen te veroorzaken door de uitdrukking van integrine β1 te verminderen.

heeft u echt zoveel drama (dood, gigantisme, vervorming) nodig om het als een CPE te beschouwen? Geen. Cellen kunnen zich gewoon anders” gedragen ” als ze geïnfecteerd zijn, maar er hetzelfde uitzien. Subtieler maar nog steeds duidelijk CPE-type van veranderingen kan verandering van groeisnelheid/kinetiek, veranderingen in een bepaalde metabolische activiteit, of veranderingen in celfunctie omvatten. Onder de verschillende virussen die dit soort CPEs kan induceren staat Zika virus. In 2015 was dit door muggen overgedragen virus overal in het nieuws omdat het microcefalie veroorzaakt, een ernstige neurologische schade gekenmerkt door een verminderde grootte van de hersenen bij foetussen. Later werd beschreven dat microcefalie het resultaat is van verscheidene Zika-veroorzaakte cytopathische gevolgen op neurale cellen, met inbegrip van celhypertrofie, de groeibeperking, de dysregulatie van de celcyclus, en celdood. Een analyse van de kolonievorming werd gebruikt, bijvoorbeeld, om te identificeren welke van de verschillende Zika-proteã nen met celproliferatie interfereren.

voor onderzoekers die systematisch de groeikinetiek van cellijnen vergelijken, raden we de CytoSMART Omni aan. Kinetische live-cell imaging van whole-wells, met behulp van geautomatiseerde scanning en beeld stiksel software. Beeld full well platen voor uren tot weken op een moment.

cytopathische effecten zijn het resultaat van interacties tussen virus en gastheer

Het is belangrijk te vermelden dat de CPE niet alleen door het virus wordt gedefinieerd, maar ook door de gastcel. Het is afhankelijk van hoe tolerant de cellen zijn aan infectie. Omdat het een tolerante cel is, een die de groei van een virus kan ondersteunen. Met andere woorden, niet alle virussen kunnen alle celtypen infecteren. Om het simpel te houden, kunnen we zeggen dat:

• niet tolerante cel – Virus kan niet infecteren
• permissieve cel – Virus kan repliceren, maar veroorzaakt geen duidelijke CPE
• zeer tolerante cel – Virus repliceert en induceert een duidelijke CPE

dus als u virus toe te voegen aan uw cellen en er gebeurt niets, maak je geen zorgen. Je moet alleen de juiste viruscelcombinatie vinden.

uitlezingen-hoe CPE meten?

Virus-geïnduceerde cellulaire veranderingen zoals celdood of een veranderde morfologie zijn zichtbaar door lichtmicroscopie. Je kunt gewoon je plaat onder een standaard omgekeerde microscoop leggen en zien of je cellen stierven of op de een of andere manier veranderden. Een positief aspect van deze aanpak is dat het “gemakkelijk” is omdat het geen verwerking van de steekproef vereist, die fixatie of het bevlekken artefacten vermijdt.

aan de andere kant is het kwalitatief en niet kwantitatief, en is het sterk afhankelijk van de opleiding van de waarnemer. Tegenwoordig, kan deze benadering worden geautomatiseerd door het doen van real-time monitoring van virus-veroorzaakte cytopathogenesis. Bijvoorbeeld, kunnen de viruswijzigingen van cel het verspreiden en proliferatie door een gekronkeld-helend analyse worden beoordeeld, waar de verminderde collectieve en eencellige migratiesnelheid samen met strenge veranderingen in celmorfologie kan worden ontdekt. Een andere kwantitatieve benadering is de controle van celproliferatie door geautomatiseerde beeldanalyse. Met deze technologie is het mogelijk om groeicurven van geïnfecteerde vs genereren. niet-besmette celculturen om het cytopathische effect goed te kwantificeren dat een virusinfectie kan hebben.

als doodscellen uw dag maken, is een alternatief de beroemde Plaque-test. Deze klassieke virologie techniek wordt gebruikt om infectieuze virale deeltjes te kwantificeren en het is gebaseerd op het principe dat virussen cellysis kunnen veroorzaken. Na het infecteren van een monolaag van zeer tolerante cellen, worden de cellen tegenbehandeld met kristalviolet (levende cellen zijn gekleurd, doodscellen blijven Onbevlekt), wat resulteert in mooie plaques (gebieden van doodscellen) die gemakkelijk met het blote oog kunnen worden gekwantificeerd.

maar u hoeft uw cellen niet te zien om te weten dat ze dood zijn. De levensvatbaarheid van de cellen na infectie kan worden gemeten door de intracellulaire ATP-concentratie te kwantificeren met firefly luciferase of met de traditionele MTT-assay.

werken met virussen kan een gedoe zijn, BSL-3/4 labs hebben strenge veiligheidsmaatregelen en het in-en uitstappen van het lab kost veel tijd. Voor onderzoekers die op zoek zijn naar een oplossing om hun cellen te monitoren, zonder het lab in te hoeven, raden we aan om te kijken naar de CytoSMART Lux2 Duo Kit.

toepassingen

veroorzaakt uw virus een CPE? Kun je het duidelijk zien of meten? Geweldig! U kunt deze CPE gebruiken als uitlezing van een succesvolle virale infectie of replicatie. Een bepaalde CPE kan dienen als een indicator om uit te vinden hoe een infectie te voorkomen, om gastheer of pathogeen factoren die nodig zijn voor een infectie te karakteriseren, om virus tropisme te identificeren, onder anderen. In de praktijk betekent dit dat het kan worden gebruikt als uitlezing voor:

• Screening en evaluatie van antivirale verbinding
  kan een geneesmiddelkandidaat CPE-vorming voorkomen?
• Screening op neutraliserende antilichamen
  kan een bepaald antilichaam virus-geïnduceerde CPE remmen?
• Surveillance van antivirale geneesmiddelresistentie (fenotypering)
  kan een bepaald virusisolaat CPE induceren in aanwezigheid van antivirale geneesmiddelen?
• karakterisatie van virustropisme
  welke celtypen zijn bij voorkeur geïnfecteerd met een virus? Waarom? (Check een recente publicatie met de beruchte SARS-CoV-2 in .)
• diagnose van virale ziekten
  infecteert een virus actief een persoon? Is het klinische monster verzameld van die persoon die CPE induceert? Laten we in gedachten houden dat de meeste diagnostische methoden (ELISA, RT-qPCR) niet detecteren infectieuze virale deeltjes.

om te concluderen …

hoewel er verschillende manieren zijn om virusinfectie te meten, blijft het controleren op CPE ‘ s in permissieve cellen een veel gebruikt alternatief. Om echt nuttig te zijn, moet je de juiste combinatie vinden: een virus, een tolerante cel en een nauwkeurige uitlezing. Zodra u deze combinatie vindt, kunnen de toepassingen heel divers en nuttig zijn, hetzij in een academische setting, in de industrie, of in de klinische diagnostiek.

leer hier meer over alle cytosmart imaging oplossingen